《Microbiology Spectrum》：Systematic establishment of approaches to the detection of equine macrophage polarization and their application in pathogenic infection
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巨噬细胞表型适应在感染过程中对炎症平衡的调控至关重要；然而，马免疫学领域因缺乏标准化鉴定的特异性工具而进展受限。为解决这一空白，研究人员建立了一种可靠的、基于抗体的方法来表征马巨噬细胞M1样和M2样标志物谱。研究人员首先通过实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)
巨噬细胞表型适应在感染过程中对炎症平衡的调控至关重要；然而，马免疫学领域因缺乏标准化鉴定的特异性工具而进展受限。为解决这一空白，研究人员建立了一种可靠的、基于抗体的方法来表征马巨噬细胞M1样和M2样标志物谱。研究人员首先通过实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)验证经典标志物基因的表达，随后制备了靶向差异表达表面蛋白CD80(M1样)和CD163(M2样)的特异性单克隆抗体(mAb)。这些新型抗体使得研究人员能够建立结合流式细胞术(flow cytometry)、蛋白质免疫印迹(Western blot)及qPCR的多模态检测方法。体外应用该方法揭示了病原体特异性的标志物谱：马流产沙门氏菌(Salmonella abortus equi)、马疱疹病毒1型(EHV-1)和马动脉炎病毒(EAV)促进早期M1样表型，而马传染性贫血病毒减毒株(EIAV)诱导M2样表型。总之，本研究为马巨噬细胞分型提供了经验证的检测体系，为未来宿主—病原体相互作用及靶向治疗研究奠定了基础。
本文发表于《Microbiology Spectrum》，针对马(Equus caballus)巨噬细胞极化(polarization)缺乏特异性检测工具及标准化鉴定方法的现状——既往多依赖间接的代谢轮廓或细胞因子分泌推断，无法对马源M1样与M2样巨噬细胞进行表面标志物的直接、可靠鉴别——研究人员旨在建立基于单克隆抗体(monoclonal antibody, mAb)的马巨噬细胞M1/M2极化表型检测系统，并应用该系统探究重要马源病原感染对巨噬细胞极化的影响。研究人员成功制备了抗马CD80（M1样标志物）与抗马CD163（M2样标志物）的单克隆抗体，通过形态学观察、qPCR、Western blot及流式细胞术(flow cytometry, FCM)验证了体外诱导的马巨噬细胞M1样（LPS+IFN-γ诱导）与M2样（IL-10诱导）模型中标志物的特异性表达，确认CD80和CD163分别为马M1样与IL-10驱动M2样表型的可靠表面标志物。应用该多模态检测体系对马源病原感染模型进行检测发现：减毒马传染性贫血病毒(attenuated EIAV)诱导巨噬细胞向M2样表型极化（CD163↑，CD80无变化），而马疱疹病毒1型(EHV-1)、马动脉炎病毒(EAV)及马流产沙门氏菌(Salmonella abortus equi)则诱导早期M1样极化（CD80↑，CD163无显著变化）。该研究不仅提供了首个针对马巨噬细胞极化标志物的特异性抗体检测工具，也为阐明马病原—巨噬细胞互作机制及疫苗/药物评价奠定了基础。
主要关键技术方法：
研究人员从健康马外周血分离单核细胞并诱导分化为马单核细胞来源巨噬细胞(equine monocyte-derived macrophages, eMDMs)；以LPS(1 μg/mL)+IFN-γ(100 ng/mL)诱导M1样极化，以IL-4(100 ng/mL)或IL-10(100 ng/mL)诱导M2样极化；通过qPCR检测TNF-α、IL-1β、IL-12(p40)、TGF-β、IL-10、CD80、CD206、CD163的mRNA动态表达以筛选特异性标志物；合成马CD80胞外区多肽及表达重组CD163胞外段蛋白免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤技术制备并筛选抗马CD80 mAb(克隆5C4)与抗马CD163 mAb(克隆1C6)，经Western blot及siRNA敲低验证特异性；采用上述单抗通过Western blot和流式细胞术检测极化模型及病原感染后CD80与CD163蛋白水平；以减毒EIAV(EIAV-DLV121)、EHV-1、EAV及S. abortus equi感染eMDMs，通过qPCR、Western blot及FCM分析极化标志物变化；所有实验设Mock对照，数据以均值±标准误(SEM)表示，Student's t检验或ANOVA进行统计学分析(n=3独立生物学重复)。
The morphology of equine macrophages exhibiting distinct marker profiles
研究人员对经IFN-γ/LPS(M1样诱导)或IL-10(M2样诱导)处理48小时的eMDMs进行共聚焦显微镜观察，发现M1样巨噬细胞丝状伪足(filopodia)密度显著高于M0(未刺激对照)及M2样细胞，且M1样细胞核呈明显伸长形态，M2样与M0核多为卵圆或圆形。结论：马巨噬细胞M1样极化伴随特征性形态学改变（丝状伪足增多、核伸长），可辅助支持分子标志物判定。
M1-like/M2-like gene expression dynamics in stimulated equine macrophages
研究人员在LPS/IFN-γ或IL-4/IL-10诱导后12、24、36、48 h提取RNA行qPCR。结果显示LPS/IFN-γ显著上调TNF-α(12 h达65倍)、IL-1β与IL-12(p40)(48 h峰值)、CD80(P<0.01)；IL-4上调TGF-β与CD206(24 h达7.4倍)，IL-10上调自分泌IL-10(48 h)与CD163(12 h达5.9倍)。值得注意的是CD206在LPS/IFN-γ下亦有上调，而CD163仅在IL-10刺激下显著升高。结论：选定CD80为M1样核心表面标志物，CD163(尤指IL-10诱导型)为M2样核心表面标志物。
Development and validation of monoclonal antibodies targeting CD80 and CD163
研究人员以KLH偶联CD80 N端15肽免疫小鼠获得抗CD80 mAb(5C4)，以原核表达纯化CD163 SRCR1~4片段免疫小鼠获得抗CD163 mAb(1C6)。Western blot显示两抗体仅识别马巨噬细胞相应内源性蛋白，不识别人(HEK293、THP-1)及小鼠(RAW 264.7)同源蛋白；siRNA敲低CD80或CD163后对应条带减弱；FCM显示LPS/IFN-γ组CD80?细胞比例36 h后显著升高，IL-10组CD163?细胞比例36 h后显著升高；共聚焦显示CD80/CD163与泛巨噬细胞标志物CD14共定位。结论：所制备单抗5C4与1C6分别特异性识别马M1样CD80与M2样CD163，适用于后续检测。
Analysis of pathogen infection of equine macrophages
研究人员以EIAV(5×10? TCID??/mL)、EHV-1(10? PFU/mL)、EAV(5×10? TCID??/mL)及S. abortus equi(1×10? CFU/mL)感染eMDMs，24 h后qPCR测病毒拷贝数或细菌CFU计数，证实各病原均被巨噬细胞有效内化/复制(EIAV、EHV-1>10? copies/cell；EAV>10? copies/cell；S. abortus equi可见菌落)。结论：病原感染模型构建成功，可用于极化分析。
qPCR analysis of phenotypic marker profiles of equine macrophages following pathogen infection
研究人员于感染后检测极化相关基因mRNA。EIAV感染上调IL-10、CD206、CD163，提示向抗炎M2样表型偏移；EHV-1、EAV及S. abortus equi感染上调TNF-α、IL-1β、CD80，提示早期以促炎M1样表型为主。结论：不同马源病原诱导特征性巨噬细胞极化基因表达谱。
Flow cytometry and western blot analysis of phenotypic changes of equine macrophages after pathogen infection
研究人员以Western blot与FCM检测感染后CD80与CD163蛋白。EIAV组CD163显著上调，CD80与Mock无差异→M2样极化；EHV-1、EAV及S. abortus equi组CD80显著上调，CD163与Mock无差异→M1样极化。阳性对照(LPS/IFN-γ上调CD80；IL-10上调CD163)验证体系可靠性。结论：减毒EIAV诱导马巨噬细胞M2样极化，EHV-1、EAV及S. abortus equi诱导M1样极化，与qPCR结果一致。
讨论与结论部分总结（翻译）：
单核细胞及单核细胞来源巨噬细胞是宿主固有免疫应答的核心效应细胞。本研究首次制备了靶向马CD80与CD163的单克隆抗体，经体外极化模型验证CD80为IFN-γ+LPS诱导M1样巨噬细胞标志物，CD163为IL-10诱导M2样巨噬细胞标志物。马M1样极化伴随促炎细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-12)上调及丝状伪足增多、核伸长；M2样极化伴随抗炎因子(TGF-β、IL-10)及CD206、CD163上调。应用该多模态检测体系发现，减毒EIAV株(EIAV-DLV121)上调M2样标志物CD163与CD206、下调M1样细胞因子，而致病性EHV-1、EAV及S. abortus equi促进M1样标志物CD80及促炎细胞因子表达。需注意本研究的局限包括未设单独LPS或IFN-γ对照、IL-4/IL-10简化M2模型不能完全模拟体内M2a/b/c亚型、传统二维培养缺乏组织微环境、巨噬细胞具可塑性可致CD80/CD163共表达挑战M1/M2二元分类，且EIAV表型结论源于减毒疫苗株不应直接推广至野毒力株。总之，本研究建立的马巨噬细胞极化标志物检测法可实现体外表型快速鉴定，具备用于马感染性疾病中巨噬细胞表型变化研究、药物筛选及免疫治疗评价的潜力，深化对病原驱动巨噬细胞极化机制的理解将助力马属动物抗感染干预与疫苗研发。
