《Beilstein Journal of Organic Chemistry》：A practical CO2-mediated synthesis of 5,6-carboxylated silicon-rhodamines for targeted probe development
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硅-罗丹明（SiR）染料因其远红光发射、高光稳定性以及可调的乳酰内酯-两性离子（L–Z）平衡而成为超分辨成像中最重要的荧光团之一。然而，其在靶向探针开发中的广泛应用受到5,6-羧基化SiR衍生物合成困难的限制，而这些衍生物是生物偶联反应中不可或缺的关键中间体。
硅-罗丹明（SiR）染料因其远红光发射、高光稳定性以及可调的乳酰内酯-两性离子（L–Z）平衡而成为超分辨成像中最重要的荧光团之一。然而，其在靶向探针开发中的广泛应用受到5,6-羧基化SiR衍生物合成困难的限制，而这些衍生物是生物偶联反应中不可或缺的关键中间体。在此，研究人员报告了一种实用的CO2介导策略，用于从溴代SiR前体出发，通过锂–卤素交换和直接羧基化反应合成5,6-羧基化SiR。该方法使用正丁基锂（n-BuLi）和易获得的CO2，以60–93%的产率获得羧基化SiR衍生物，同时避免了叔丁基锂（t-BuLi）、剧毒CO以及昂贵的钯催化剂的使用。此外，粗羧基化反应混合物可直接用于酰胺偶联反应而无需色谱纯化，从而实现一锅法制备HaloTag靶向SiR探针。所得探针成功应用于长期活细胞超分辨成像，实现了对丝状伪足（filopodia）动态和线粒体重塑的可视化。该工作为功能化SiR染料的合成建立了简洁高效的路线，并促进了靶向SiR探针的快速开发。
硅-罗丹明（SiR）染料凭借其远红光发射（典型发射波长λ
em ≈ 650–670 nm）、高亮度、优异光稳定性以及独特的乳酰内酯-两性离子（L–Z）平衡特性，已成为活细胞超分辨成像中最为实用的罗丹明骨架。L–Z平衡的可调控性使得SiR能够以非荧光螺内酯（spirolactone）形式存在，而在靶标结合后转变为荧光两性离子形式，产生强烈的荧光生成响应（fluorogenic response），从而显著提升信噪比（SNR），特别适用于单分子定位显微镜（SMLM）等超分辨技术。此外，羟甲基取代的SiR衍生物如HMSiR和Aze-HMSiR具有自发闪烁（spontaneous blinking）特性，进一步拓展了SiR在活细胞成像中的应用广度。
尽管SiR染料的光物理性质优化已相当成熟，但其化学结构的更广泛拓展却日益受到5,6-羧基化SiR衍生物可及性有限的制约。羧基作为生物偶联的通用且高效手柄，是构建HaloTag、SNAP-tag、肽类及小分子偶联等各类靶向SiR探针的核心。传统的5,6-羧基化SiR合成路线通常依赖于预安装保护的含羧基底物，经环化构建SiR骨架后再脱保护。然而，羧基取代基的强吸电子效应降低了底物反应活性，导致关键关环步骤效率低下、总产率偏低。同时，这些方法常需使用高反应活性的叔丁基锂（t-BuLi），操作危险性高，且受保护羧基底物的制备往往繁琐复杂。Butkevich等人虽开发了基于溴代前体的改进策略，通过钯催化羰基化反应引入羧基，但该方法仍依赖原位CO生成装置及昂贵的钯催化剂，增加了操作复杂性、安全顾虑和合成成本，限制了其实际应用。
针对上述局限，研究人员开发了一种CO
2介导的直接羧基化策略，用于从溴代SiR前体高效合成5,6-羧基化SiR衍生物。该策略将金属化芳基卤化物与CO
2的经典羧基化反应引入SiR化学，利用正丁基锂（n-BuLi）和易得的CO
2在标准Schlenk条件下实现转化。
在合成研究中，三种溴代SiR前体1a–c经2.5当量n-BuLi在-78 °C无水THF中处理生成芳基锂中间体，随后通过气球引入CO
2，室温搅拌过夜确保完全捕获。粗产物直接经HPLC分析，产物3a、3b和3c的产率分别为93%、60%和77%。该反应中观察到未羧基化的副产物，源于芳基锂中间体被痕量水或质子源质子化，但这类副产物因缺乏羧基而无法参与后续酰胺偶联，对后续反应干扰较小。基于此，研究人员发展了一锅法功能化策略：羧基化反应混合物经乙酸乙酯萃取浓缩后，直接与HaloTag胺进行酰胺偶联（HATU/DIPEA活化体系），获得探针4a、4b和4c，总产率分别为62%、37%和46%。光谱分析显示这些探针具有典型的SiR远红荧光（发射峰约640 nm）。
在长期活细胞超分辨成像应用中，探针4a（HMSiR-Halo）和4b（AzeHMSiR-Halo）因优异的自发闪烁性能而被用于单分子定位显微镜（SMLM）成像。研究中使用Lifeact-HaloTag标记肌动蛋白丝、H2B-HaloTag标记细胞核、TOMM20-HaloTag标记线粒体外膜，均获得高质量超分辨图像，定位精度达24–46 nm。其中4b因高亮度表现更优（定位精度24.9 nm），成功实现了丝状伪足生长和摆动动态的长程实时追踪。4c则作为实用的荧光生成型HaloTag探针应用于结构照明超分辨显微镜（SIM）成像，成功揭示了线粒体网络在时间维度上的可逆"缠绕-解绕"重塑过程。
该工作的结论是：研究人员开发了一种实用的CO
2介导策略，用于从溴代SiR前体经锂–卤素交换和直接羧基化合成5,6-羧基化硅-罗丹明（SiR）衍生物。该方法在温和条件下高效获得羧基化SiR，同时避免了叔丁基锂（t-BuLi）、剧毒CO以及昂贵钯催化剂的使用。粗羧基化混合物可直接用于酰胺偶联而无需色谱纯化，实现了功能化SiR探针的 streamlined 一锅法构建。利用该方法，多种高性能探针被便捷制备，并成功应用于长期活细胞超分辨成像。总体而言，该工作提升了功能化SiR染料的合成可及性，为靶向超分辨探针的快速开发提供了简洁多用的平台。
