Sox10Dom品系Hirschsprung小鼠家系的组合多组学分析鉴定出多个调控肠神经系统发育的高置信度候选修饰因子

《PLOS Computational Biology》：Combinatorial multiomic analysis from a pedigree of Sox10Dom Hirschsprung mice identifies multiple high confidence candidate modifiers of Enteric Nervous System development

　　

先天性巨结肠症（HSCR)以远端肠道不同长度的肠神经节缺失（无神经节症）为特征。该疾病源于肠神经嵴来源细胞（ENCDC)对胎儿肠道的定植不足。HSCR表现出复杂的、多因素的遗传模式，即使在同一家族内，外显率和严重程度差异也很大。SOX10是导致无神经节症的致病基因之一。然而，基因相互作用如何影响HSCR无神经节症的严重程度尚不清楚。此前通过标准F1代杂交对Sox10^Dom HSCR小鼠模型的无神经节症修饰因子进行了定位。本研究采用了一种新的策略，对混合遗传背景下的Sox10^Dom小鼠扩展家系进行基因分型。该家系中的全基因组关联分析（GWAS)指向了新的无神经节症修饰区间，并对先前的修饰区域进行了复制和精细定位。通过对发育中的肠神经系统（ENS)进行补充的组学分析，研究人员基于基因表达、染色质可及性以及保守的SOX10结合基序的存在，在这些修饰区间内鉴定出多个高优先级候选基因。研究人员实施了一个优先排序流程来对潜在的修饰因子进行排序，生成的候选列表中既包括多个已知对ENS发育有影响的基因，也包括多个新基因。在这些新基因中，Dach1被列为优先候选基因，可修饰ENCDC的迁移从而影响无神经节症的严重程度。研究结果确定了含有内在基因的基因组区间，这些基因是修饰Sox10^Dom无神经节症严重程度的合理候选。研究人员还注意到，无神经节症修饰候选基因的若干个人类直系同源基因位于与肠道运动力障碍遗传变异存在连锁不平衡的区块中，这为深入理解人类HSCR严重程度提供了生物学洞见。

本研究聚焦于先天性巨结肠症（Hirschsprung disease, HSCR)的遗传修饰机制，发表于《PLOS Computational Biology》。HSCR是一种以远端肠道肠神经节缺失（无神经节症，aganglionosis）为特征的复杂遗传性神经发育障碍，其临床严重程度在同一家族内部甚至不同受累同胞之间都可能存在显著差异。尽管已有多个孟德尔致病基因被鉴定，但关于基因相互作用如何调控无神经节症严重程度的变异机制仍知之甚少。肠神经系统（Enteric Nervous System, ENS)的正常发育依赖于肠神经嵴来源细胞（Enteric Neural Crest-Derived Cells, ENCDCs)对胎儿肠道的成功定植，而这一过程的任何障碍都可能导致HSCR。

传统上，人类HSCR遗传研究主要集中于孟德尔致病基因的鉴定，而对于疾病外显率和严重程度的特征性变异关注相对有限。虽然多项全基因组关联研究（GWAS)已发现与HSCR相关的常见遗传变异位点，但截至目前，尚无人类研究对调控无神经节症长度（即临床严重程度)的遗传变异进行定量分析。相比之下，小鼠模型在可控遗传背景下能够精确测量无神经节症长度，为解析严重程度背后的遗传基础提供了独特优势。

研究人员利用Sox10^Dom小鼠模型——该模型能够重现人类HSCR中无神经节症长度的变异性——构建了一个10代扩展家系，共830只杂合子受影响小鼠。该家系通过将受影响的Sox10^Dom雄性与野生型F₁ B6C3Fe-a/a雌性 iterative outcross 繁殖而建立，每一代都重新引入了C57BL/6J背景上效应更强的等位基因。这种设计相比标准F₂代杂交能够积累更多的减数分裂重组事件，从而提高遗传定位分辨率。研究人员使用包含1449个SNP的标准小鼠连锁作图面板（其中876个在该家系中具有信息性)对所有个体进行基因分型，采用基因组高效混合模型分析（GEMMA)进行全基因组关联分析，该软件能够校正近交品系亲缘关系导致的假阳性。

为从巨大的修饰区间中筛选优先候选基因，研究人员整合了多组学数据进行系统分析。首先利用scRNA-seq数据（来源于9.5-15.5天胚龄的整个小鼠胎儿肠道)鉴定在ENCDCs及周围肠道间充质中表达的基因；其次通过11.5天胚龄ENCDC迁移波前与滞后细胞的bulk RNA-seq差异表达分析，筛选与迁移能力相关的基因；进而利用16.5天胚龄Phox2b H2B-CFP转基因小鼠的SNP来源肠道制备的snATAC-seq数据，分析ENS神经元前体中的染色质可及性；同时考察了跨鸡、小鼠、人类基因组保守的二聚体SOX10结合基序在修饰区间内的分布。

研究结果表明，GEMMA分析在染色体5上发现了一个经多重检验校正后仍显著的无神经节症修饰区间（LOD=3.9)，该区间包含已知ENS发育关键基因Phox2b，作为内部对照验证了分析流程的可靠性。此外，还在多条染色体上检测到名义显著的候选修饰位点，部分呈现性别偏向效应。与以往F1代杂交研究的对比显示，染色体5、8、11、14上的修饰区间得到复制，同时新发现了染色体1、2、3、13、19上的修饰区间。性别分层分析揭示Phox2b在雄性中具有更强的关联信号，而Mcm3等基因可能呈现雌性偏向的修饰效应。

通过组合多组学证据的优先排序流程，研究人员从6216个修饰区间基因中逐步筛选，最终鉴定出19个兼具遗传证据和多组学支持的高优先级候选修饰基因。这些基因包括已知的ENS发育调控因子如Ednrb、Nrg1、Col1a1、Phox2b，以及新发现的候选基因Dach1、Tbx2、Pdgfra等。其中Dach1获得了最高的组学证据评分（5分）：该基因在迁移中的 ENCDCs 中表达，其旁侧存在保守SOX10结合基序，且在ENS神经元前体中处于开放的染色质区域。Col1a1、Pdgfra和Tbx2则获得了4分组学证据支持。

进一步分析候选基因与Sox10的共表达模式显示，Dach1、Phox2b、Ednrb、Tbx2在13.5天胚龄ENCDC迁移阶段与Sox10存在广泛的共表达，提示它们可能与SOX10存在直接的功能互作。对C3HeB/FeJ与C57BL/6J品系间序列变异的分析发现，Phox2b和Col1a1含有预测高功能影响的C3Fe变异，可能通过影响剪接效率调控基因表达水平。

在讨论部分，研究人员强调了多点关键发现。首先，该研究成功改进了Sox10^Dom无神经节症修饰区间的定位精度，尽管修饰区间仍然较大（部分超过10Mb)，但扩展家系的设计确实提供了比标准杂交更高的重组分辨率。其次，零膨胀表型的存在是该研究的重要挑战——约30%的家系成员未检测到无神经节症，这要求研究人员采用定量表型、二元表型转换以及leave-one-chromosome-out等多种分析策略相互补充。第三，多组学整合策略的有效性得到验证：已知ENS基因Phox2b、Ednrb的成功检出证明了流程的可靠性，而新基因Dach1的突出表现为后续功能研究指明了方向。

研究特别指出Dach1作为最高优先级新候选修饰因子的多重依据：除遗传区间复制外，既往研究报道Dach1突变影响神经嵴迁移，本次组学分析又揭示其具备SOX10结合位点、开放染色质和迁移波前差异表达等多重特征。研究人员推测，不同候选基因可能通过调控ENCDC迁移的不同方面（如定向迁移、增殖、分化)来影响无神经节症严重程度，并构建了相应的假设模型。

最后，研究人员将候选基因与人类数据进行了关联分析。发现Phox2b、Col1a1、Rbpj、Nrg1、Ednrb、Hoxb2/5/13、Uchl1等基因的人类直系同源基因位于HSCR GWAS显著SNP的连锁不平衡区块内；Col1a1、Rbpj、Nrg1、Elf1还与肠道排便频率GWAS显著SNP存在连锁不平衡。Genebass数据库的表型-基因关联分析显示，DACH1与多种胃肠道手术表型相关，包括常用于HSCR治疗的"直肠前切除伴肠外置术"。

研究结论指出：通过扩展家系分析提高了Sox10^Dom/+无神经节症修饰区间的分辨率；组合多组学分析鉴定出满足多重遗传和基因组学标准的高优先级修饰基因列表；Phox2b作为已知ENS基因的检出验证了整体策略；Dach1作为Sox10^Dom无神经节症新修饰因子脱颖而出，其累积证据包括跨研究遗传区间复制、Dach1突变对神经嵴迁移影响的既往报道、以及SOX10结合位点周围开放染色质的组学证据。该分析丰富了影响ENS发育的基因网络，并为未来人类HSCR及其他胃肠道运动障碍的变异分析揭示了重要靶点。