多模态FRACTAL-MSI与图像融合技术提升生物分子成像的检测能力与分辨率

《ACS Central Science》：Multimodal FRACTAL-MSI and Image Fusion Improves Detection and Resolution of Biomolecule Imaging

　　

通过金属偶联抗体进行的生物分子元素质谱成像（MSI）能够实现高度多重、原位定量分析。然而，检测器灵敏度限制了低丰度分析物的元素MSI检测以及所获图像的空间分辨率。为克服这一限制，研究人员引入了FRACTAL-MSI，这是一种信号放大方法，它通过循环染色靶分子进行荧光信号放大（FRACTAL），并适应于多模态激光剥蚀-电感耦合等离子体质谱（LA-ICP-MS）和免疫荧光（IF）成像，方法是在同一组织切片上交替使用荧光标记和镧系元素标记的二抗。以NeuN作为模型神经元标记物，研究人员在新鲜冷冻的小鼠脑组织、福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织以及SH-SY5Y细胞中证明了IF和LA-ICP-MS信号有23-80倍的放大。随后，研究人员开发了两种无需机器学习的图像融合方法，利用真实的探针共定位，在IF分辨率下生成定量的元素图像。增强的灵敏度允许对LA-ICP-MS数据进行超分辨率重建，以获得250纳米分辨率（即亚细胞水平）的图像，该分辨率优于通过图像融合获得的40倍IF图像。研究人员还在一个4重元素面板中展示了选择性靶标放大。总之，FRACTAL-MSI提供了一种实用、广泛可及的策略，以提高低丰度生物分子的检测能力，进而提升其成像分辨率。

**研究背景与问题**
元素质谱成像（MSI）技术，特别是激光剥蚀-电感耦合等离子体质谱（LA-ICP-MS）和二次离子质谱（SIMS），利用金属偶联探针（如抗体）对生物分子（如蛋白质、mRNA）进行成像，可实现高度多重、定量的原位分析，在细胞分辨率下解析组织中的细胞类型、变化及相互作用，已应用于临床试验（如眼病诊断、乳腺癌多细胞动态图谱绘制、黑色素瘤治疗指导）。相较于免疫荧光（IF）等技术，元素MSI在多路复用分析方面具有优势，避免了通道串扰或自发荧光的干扰。然而，随着元素MSI分辨率接近IF显微镜，其主要限制与IF曾面临的历史障碍相同：检测器信号强度不足，难以检测低丰度生物标志物。在亚细胞区域准确测定生物标志物丰度的微小变化对于理解疾病状态及其进展至关重要，因此需要替代策略来通过元素MSI测量这些变化。

**研究意义与方法概述**
本研究发表在《ACS Central Science》上，旨在解决元素MSI在检测低丰度靶标时灵敏度不足以及在成像小光斑尺寸时面临的信噪比权衡问题。研究人员开发并验证了一种名为FRACTAL-MSI的多模态信号放大与图像融合新策略。该策略的核心是：在单个组织切片上，通过循环应用荧光标记和金属标记的二抗层，对靶标进行信号放大；随后，利用两种无需机器学习的方法，将放大的LA-ICP-MS图像与高分辨率IF图像进行像素级融合，以提升元素图像的分辨率并保留定量信息。主要技术方法包括：1）**FRACTAL-MSI信号放大方案**：基于改进的FRACTAL原理，在新鲜冷冻小鼠脑组织、SH-SY5Y细胞系（包括未分化与经PMA分化的细胞）以及FFPE大鼠脑组织样本上，对神经元核抗原（NeuN）进行循环染色，依次使用FITC标记的二抗和¹⁶⁹Tm标记的三抗，构建多达5个“世代”（G-level）的抗体层。2）**多模态成像**：使用ZEISS AxioScan Z.1 slide scanner获取40倍放大的免疫荧光图像；使用Elemental Scientific Lasers imageBIO 266 nm激光剥蚀系统耦合Agilent 7900系列ICP-MS进行LA-ICP-MS成像，光斑尺寸为1微米或5微米，并应用超分辨率重建技术获取250纳米分辨率的图像。3）**图像融合与数据处理**：开发了像素重分布图像融合（PRIF）和累积分布函数图像融合（CDFIF）两种算法，利用Python脚本实现LA-ICP-MS图像与IF图像的像素级配准与融合。4）**多重分析验证**：在4-plex分析中，额外加入针对CD45和MMP-11的金属标记一抗以及¹⁹³Ir嵌入剂（标记细胞核），验证FRACTAL-MSI在多重工作流程中的选择性放大能力。

**研究结果**
**多模态IF与元素MSI信号放大**：研究人员首先验证了将金属标记二抗整合到FRACTAL循环抗体层应用过程中的可行性。理论计算表明，随着G-level增加，结合的抗体数量呈非线性增长（例如，G5理论上包含682个荧光分析物和1364个元素分析物）。实验结果显示，在新鲜冷冻小鼠脑组织中，从G1到G5，IF荧光强度和¹⁶⁹Tm的LA-ICP-MS信号均显著增强，放大倍数在23至80倍之间，且IF与LA-ICP-MS的放大程度基本一致（除G3外存在一定差异，可能源于荧光淬灭、相机响应非线性或LA-ICP-MS更大的线性动态范围）。信号增强在G4后趋于平缓，这与原始FRACTAL方法观察到的趋势一致。

**图像融合提升分辨率**：尽管信号得到放大，但定量LA-ICP-MS图像的分辨率（例如5微米）仍低于IF图像（0.33微米）。为解决此问题，研究人员开发了两种图像融合方法。以5微米分辨率的LA-ICP-MS图像为例，PRIF方法将每个LA-ICP-MS像素的浓度均匀重分配到其对应的阳性IF信号像素上；CDFIF方法则利用两者的强度直方图，将IF图像的分布归一化到定量LA-ICP-MS图像的浓度单位（mg kg^–1）。两种方法均成功将LA-ICP-MS图像的分辨率提升至IF水平（图3c, d），清晰分辨出在原始LA-ICP-MS图像中看似单个的神经元实际上是两个相邻细胞，且首次在图像融合后保留了定量信息。

**在不同样本类型中的应用**：1）**细胞样本（SH-SY5Y）**：在未分化和分化的SH-SY5Y细胞中，G1水平的信号接近背景噪音，而G5水平则产生可定量的¹⁶⁹Tm信号。使用1微米光斑成像时，分化细胞显示出NeuN的高丰度局部区域，这与之前的IF观察结果一致。当LA-ICP-MS分辨率提高到1微米后，图像融合带来的改善相对5微米时减小，表明高分辨率的LA-ICP-MS图像本身已具有较高的保真度。2）**FFPE组织**：在FFPE大鼠脑组织中，常规G1染色（IF和LA-ICP-MS）均未检测到明显的NeuN阳性信号，这归因于FFPE处理可能掩盖了表位的自然丰度。然而，在放大至G5后，荧光和LA-ICP-MS图像均清晰显示出神经元，表明FRACTAL-MSI能够克服FFPE过程造成的表位隐藏问题。此外，LA-ICP-MS图像不受IF图像中存在的自发荧光伪影影响。

**通过超分辨率重建实现纳米级成像**：得益于FRACTAL-MSI提供的增强检测灵敏度，研究人员对G3染色的样本应用了超分辨率重建技术，获得了分辨率为250纳米的定量LA-ICP-MS图像（图6b）。该分辨率优于40倍IF图像（330纳米）。叠加图像显示两种成像模式基本一致，但SRR图像噪声更高，且部分IF中荧光较弱的细胞在LA-ICP-MS图像中未显示，这可能与细胞在组织切片深度分布不均或SRR处理过程有关。

**在多路复用工作流程中的应用**：研究人员在包含NeuN（放大）、CD45、MMP-11和细胞核（Ir嵌入剂）的4-plex分析中测试了选择性放大。使用5微米光斑成功获得了四重假彩色图像，显示CD45（跨膜蛋白）和MMP-11（细胞内酶）与NeuN在正常成年小鼠脑中共定位，符合预期。尝试使用1微米光斑时，未放大的靶标（MMP-11、CD45、Ir）信号过低无法定量，表明更高分辨率的多路成像可能需要替代性质谱仪（如ICP-TOF）以维持灵敏度。

**讨论与结论**
**讨论部分总结**：本研究开发了一种在单个组织切片上进行多模态IF和LA-ICP-MS成像的方案，用于信号放大和辅助无需机器学习的图像融合，该方案适用于新鲜冷冻组织、固定细胞和FFPE组织。该方法灵活、简单，所有试剂均为商品化产品。与先前报道的信号放大方法（如SABER-IMC）相比，FRACTAL-MSI具有定量能力且更易于实施。本研究首次展示了利用图像融合提升定量LA-ICP-MS图像分辨率的方法。PRIF和CDFIF各有优劣：PRIF适用于在特定感兴趣区域确定浓度，但需要精确的图像配准且会增加图像噪声；CDFIF提供更高分辨率的图像但继承了IF的缺陷（如自发荧光）。两种方法均受各自成像模式伪影的影响。与依赖机器学习的融合方法不同，本研究的方法不受小样本队列限制，但要求每种成像模式都有兼容的探针。FRACTAL-MSI也存在局限性：由于放大过程和抗体-金属标记偶联的异质性，定量是相对的而非绝对的；多重分析受限于抗体宿主物种间的交叉反应性，目前最多可放大4个表位；图像融合在LA-ICP-MS分辨率为1微米时受自发荧光和噪声影响较大；更高的多重分析和分辨率可能需要更灵敏的仪器。未来可通过使用更高量子产率的荧光染料、时间门控荧光成像或与其他非破坏性MSI技术（如MALDI-MSI）结合来改进。

**研究结论翻译**：本研究提出了FRACTAL-MSI，这是一种简单灵活的多模态放大策略，它将循环二抗分层与双荧光和金属标记相结合，以解决使用元素MSI分析生物分子时两个持续存在的限制：对低丰度靶标的灵敏度不足，以及在小光斑尺寸成像时固有的信号与分辨率权衡问题。通过将该方法应用于NeuN的分析，研究表明该方法适用于新鲜冷冻脑组织、培养细胞和FFPE组织，在五个世代的循环二抗应用中，定量¹⁶⁹Tm信号显著增加。重要的是，FRACTAL-MSI能够在常规免疫标记常失败的FFPE样本中检测到NeuN，这表明放大有助于恢复因固定和包埋而掩盖的表位信号，并可能扩展存档组织中可访问的生物标志物空间。单个切片上共定位的多模态标记也解锁了新一代定量、无需机器学习的LA-ICP-MS图像融合技术。PRIF和CDFIF将5微米元素图像的空间细节增强至IF显微镜的分辨率，同时保留了定量信息。当元素像素尺寸接近1微米时，融合的好处减弱，因为LA-ICP-MS和IF的分辨率趋于一致。增强的灵敏度进一步实现了250纳米分辨率的纳米级超分辨率重建，展示了LA-ICP-MS在某些背景下接近甚至超过40倍IF空间尺度的途径。虽然SRR引入了更多噪声，但这些结果强调了放大对于推动现有仪器性能极限的价值。最后，概念验证的多重分析表明，FRACTAL-MSI可以与金属标记的一抗结合使用，以在多分析物面板中选择性放关键靶标，尽管更广泛的多重扩展需要仔细选择宿主物种，并可能受益于在更短驻留时间内提供更高灵敏度的替代性质谱分析器。总体而言，FRACTAL-MSI为元素生物成像中提高灵敏度和分辨率提供了一条易于获取、试剂现成的途径，实现了定量的多模态融合，并促进了在具有挑战性的样本类型中检测低丰度生物标志物。该工作流程应易于适应其他表位和成像平台，并为未来向更高重数、更高分辨率和更具临床转化潜力的MSI免疫图谱发展奠定了坚实基础。