纳米酶数字印刷于纺织品：一种整合抗菌与抗生物膜策略的方法

《ACS Omega》：Digital Printing of Nanoenabled Enzymes on Textiles: An Integrated Antimicrobial and Antibiofilm Approach

　　

生物膜在纺织品表面的形成对医疗保健、工业及日常生活构成重大挑战，导致微生物污染、感染及材料降解。在生物膜形成病原体中，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）因其多重耐药性及逃避传统抗生素的能力而尤为令人关注，显著增加了医疗负担。为应对这一问题，研究人员开发了数字化印刷负载多模态银-壳聚糖-酰基酶纳米颗粒（AgCS@AC NPs）的医用纺织品。赋予抗菌与群体淬灭（quorum-quenching, QQ）特性的织物可抑制铜绿假单胞菌的细菌生长及生物膜形成。酰基酶（acylase）通过干扰细菌通讯的群体感应（quorum-sensing, QS）过程并阻止生物膜发育，而纳米颗粒中的AgCS组分则提供抗菌功效。细胞毒性试验证实，印刷的AgCS@AC NPs不会损害人成纤维细胞或角质形成细胞的活力，确保了生物相容性。这种环保、可扩展且多功能的数字印刷技术经创新验证，可用于生产适用于医疗应用的酶功能化纳米复合抗菌纺织品。

## 研究背景与问题提出

医疗保健相关感染（healthcare-associated infections, HAIs）仍是全球性的重大健康挑战，美国每日约有31分之1的住院患者受到影响。世界卫生组织2015年《抗菌素耐药性全球行动计划》警告称，抗菌素耐药性（antimicrobial resistance, AMR）正威胁"现代医学的核心"。2024年联合国大会承诺到2030年将每年495万例AMR相关死亡减少10%。在这些最具挑战性的病原体中，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）堪称多重耐药性威胁的典型代表。作为世界卫生组织列为新型抗生素优先开发对象的病原体，这种机会性细菌占严重HAIs的7.5%和多重耐药菌血症病例的25%以上，危重患者死亡率超过40%，每例治疗费用平均达4万美元。

铜绿假单胞菌的致病性根本上由其精密的生物膜结构所驱动，细菌群落被包裹在自产的胞外基质中，获得对抗生素的短暂保护，促进耐药性发展。生物膜对抗生素的耐受性是多因素的，涉及物理、生理和遗传决定因素，其中抗生素耐药性由反复暴露于高水平抗生素所引发的突变驱动。这种生物膜发展通过N-酰基高丝氨酸内酯（N-acyl homoserine lactones, AHLs）介导的群体感应系统调控，实现群体范围的毒力因子表达和表面定植协调。近期对QS机制的研究进展揭示，破坏这些通讯通路即群体淬灭（quorum quenching, QQ），提供了一种规避传统耐药性选择压力的有前景的抗毒力策略，同时靶向生物膜相关感染的根本原因。QQ酶，特别是AHL酰基酶，已证明能够化学降解信号分子，阻止信号接收并抑制多种细菌物种（包括铜绿假单胞菌）的生物膜形成。先进的纳米制剂结合酰基酶已显示出显著的协同效应，纳米杂化庆大霉素/酰基酶系统展现出较传统抗生素提高16倍的杀菌活性和97%的毒力因子产生抑制。

基于纳米颗粒（nanoparticle, NP）的抗菌剂在克服生物膜耐药性方面显示出重要前景，研究报告其具有增强的渗透能力和新颖的作用机制。层层组装涂层方法已成功整合QQ酶与银纳米颗粒，实现协同杀菌效应，而负载抗菌剂的囊泡则实现了对胞内病原体的有效靶向。然而，将这些先进抗菌策略与纺织应用相结合受到沉积技术根本性局限的阻碍。传统方法包括浸涂、喷涂和轧染，存在严重缺陷：抗菌剂分布不均导致抗菌性能不稳定、大量材料浪费、涂层厚度和形态控制不良，以及最关键的是可能对酶等敏感生物活性成分造成变性的热应力和机械应力。这些技术壁垒在实验室抗菌功效验证与临床可行纺织产品规模化制造之间制造了鸿沟，成为应对HAI危机的重大瓶颈。

数字印刷技术通过其非接触、数字化控制的沉积能力， revolutionized多个领域的精密制造。在电子领域，喷墨印刷实现了柔性电路和有机光伏导电油墨的亚微米级放置，通量超过1000 m²/h。在药物制造中，数字印刷促进了个性化给药并实现单剂量形式中的复杂多药组合。纺织生物功能化的最新进展已证明，通过优化的油墨配方和印刷参数，溶菌酶和酪氨酸酶等酶可成功喷墨印刷到合成织物上同时保持酶活性。此外，数字喷墨印刷已实现棉织物上银纳米颗粒基抗菌剂的均匀沉积，建立了纳米颗粒纺织功能化的关键方案。然而，将QQ酶与抗菌纳米颗粒整合于数字印刷纺织品中仍是尚未探索的前沿领域，具有对抗生物膜相关感染的变革性潜力。

## 研究设计与核心结论

本研究首次成功将QQ酶功能化的银-壳聚糖纳米颗粒（AgCS@AC NPs）数字印刷到纺织品上，建立了制造活性抗菌表面的新范式。该研究基于已建立的酶喷墨印刷方案，通过控制液滴形成和优化油墨流变学保持生物活性，同时将抗菌纳米颗粒与QQ活性相结合实现领域推进。该方法整合三种协同机制：银纳米颗粒通过膜破坏和活性氧（reactive oxygen species, ROS）产生提供广谱抗菌活性；壳聚糖提供生物相容性成膜特性并结合内在抗菌活性；酰基酶通过降解AHL信号分子破坏细菌通讯。数字印刷过程相比传统涂层方法显著减少材料浪费，通过受控液滴形成和温和沉积保护酶结构完整性，并实现精确空间图案化，具有可复现、可扩展的加工特性，适合工业制造。

该多学科方法同时应对三个关键医疗挑战：_heightened antimicrobial efficacy降低HAI发生率、通过抗毒力靶向限制AMR发展、通过减少废物和工艺效率推进可持续制造。研究证明，采用该方法制造的纳米功能化纺织品对浮游和生物膜相关铜绿假单胞菌均表现出优越性能，同时保持与人成纤维细胞（BJ5tα）和角质形成细胞（HaCat）细胞系的生物相容性。该工作将数字印刷定位为下一代抗菌纺织品的变革性平台，在手术单、伤口敷料和个人防护装备中具有即时应用价值，从而推进全球抗击AMR和改善患者结局的努力。

## 关键技术方法

研究采用的主要技术方法包括：基于先前开发方案合成AgCS@AC NPs，通过还原银离子并与酰基酶偶联制备纳米杂化结构；使用羧甲基纤维素（carboxymethyl cellulose, CMC）作为粘度调节剂、Triton-X 100作为非离子表面活性剂配制印刷油墨，调控粘度为7-11 mPa·s、表面张力为32-36 mN/m；采用大气压辉光放电等离子体处理棉织物以增强表面粘附；使用压电喷墨打印头（Dimatix Sapphire QS-256/80）进行DROP-ON-DEMAND（按需滴落）喷墨印刷；通过紫外-可见光谱、傅里叶变换红外光谱（Fourier-transform infrared, FTIR）、透射电子显微镜（transmission electron microscope, TEM）、Zeta电位测定和电感耦合等离子体质谱（inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS）进行纳米颗粒表征；采用标准微生物学方法评估抗菌和抗生物膜活性；利用紫色色杆菌（Chromobacterium violaceum）CV026生物测定法验证QQ活性；通过alamarBlue法和荧光显微镜进行人皮肤细胞的细胞毒性评估。

## 研究结果

### AgCS@AC NPs的表征

纳米颗粒的形成及在印刷油墨中的稳定性通过紫外-可见光谱和FTIR光谱确认。壳聚糖的FTIR光谱在纳米颗粒形成后发生变化，3600-3100 cm^-1区域信号减弱，2850 cm^-1、1550 cm^-1和1380 cm^-1处出现新峰，与聚合物与金属的相互作用及羟基氧化相关。酰基酶I的存在通过酰胺I和II信号新峰（1650/1550 cm^-1）确认。紫外-可见光谱在420 nm处检测到典型表面等离子体共振（surface plasmon resonance, SPR）信号，且该峰在酰基酶I功能化后及AgCS@AC NPs-CMC油墨中均存在，表明纳米颗粒在印刷油墨中保持分散和胶体稳定性。纳米结构最终ζ-电位为28.6 ± 0.85 mV。TEM图像显示AgCS@AC NPs约为35 nm，表面覆盖有机材料层对应于酰基酶I。配制于CMC油墨后，纳米颗粒尺寸、形态或分布无变化，表明油墨不影响纳米结构稳定性。

### AgCS@AC NPs在印刷油墨中的抗菌活性

评估纳米杂化物对铜绿假单胞菌生长抑制效果的实验表明，不含纳米颗粒的CMC油墨细菌生长抑制率低于20%，不具抗菌效果。而水相和CMC油墨中的AgCS@AC NPs在银浓度7Beauty 7 ppm时均完全抑制细菌生长，在3.5 ppm时虽检测到低抗菌活性，但两种配方性能相似且不受CMC油墨影响。抗生物膜测定中，由于结晶紫可能与油墨溶液发生交叉反应，采用菌落计数替代方法。含纳米颗粒油墨在3.5 ppm银浓度时与水相分散液性能相当，使生物膜中细菌数量减少约2.2个对数单位，而无纳米颗粒油墨组生物膜细菌数与对照组相同。结果表明酶在CMC油墨存在下未显著失活。

### 棉织物上AgCS@AC NPs印刷品的表征

CMC油墨印刷到棉纺织品上时未出现显著喷嘴堵塞或可见卫星滴，表明与所用打印头良好兼容。等离子体处理后油墨均匀覆盖印刷区域。FTIR分析显示，含纳米颗粒油墨样品出现1650 cm^-1和1550 cm^-1新信号，对应C═O和酰胺N-H基团伸缩振动，证实涂层中存在壳聚糖和酰基酶。水接触角从原棉的28.7°几乎翻倍至56.6°，表明向更疏水行为转变，有利于阻碍初始微生物附着，但整体仍保持亲水性。SEM分析显示，印刷织物表面存在约40-50 nm的不规则纳米结构，单独分布或形成小聚集体；EDX光谱在2.98和3.15 keV处显示银Lα和Lβ发射线特征峰，确认银的存在。棉纤维在印刷织物中呈现部分嵌入或"粘合"状态，与未处理样品的分离纤维不同，归因于CMC在干燥后形成纤维间桥联薄层。XPS分析在印刷样品中检测到370和376 eV处的Ag 3d新信号，以及402 eV处归因于壳聚糖和酰基酶N 1s的峰。ICP-MS银释放实验显示，纺织品初始银含量约1.65 μg/cm²，7天PBS孵育后首小时约10%银释放（可能对应弱附着纳米颗粒），最终约45%银保留于织物上，显示良好保留性和持续抗菌活性潜力。

### AgCS@AC NP印刷织物的抗菌性能评估

接触杀菌实验中，原棉织物未减少细菌生长，而纳米颗粒印刷样品显著降低铜绿假单胞菌活力，接触3小时后实现约2.5个对数单位减少。抗生物膜能力方面，与原棉相比，AgCS@AC NP印刷织物抑制铜绿假单胞菌生物膜形成，使表面存活生物膜形成细菌数量减少2.3个对数单位。SEM图像证实，原纤维表面存在密集完整的杆状铜绿假单胞菌细胞，而纳米颗粒功能化样品几乎完全抑制生物膜形成。这些结果阐释了多模态AgCS@AC NPs的作用机制：银和壳聚糖杀灭细菌；酰基酶淬灭QS过程，阻止生物膜形成。

随后的QQ测定证实该生物活性源于酰基酶对AHL信号分子的降解。将织物样品置于接种紫色色杆菌CV026（自身不能产生AHL、需外源QS分子补充以产生紫色色素violacein）的LB琼脂平板上，滴加AHL溶液孵育后，无纳米颗粒样品未显示细菌生长抑制，排除银的干扰。不含AHL的阴性对照不能合成紫色色素；含AHL及原棉组产生清晰紫色晕圈；而纳米颗粒印刷织物阻碍紫色色素产生，使色素强度降低95%。先前研究已证明AgCS NPs不能裂解AHL，仅酰基酶I功能化赋予纳米结构QQ活性，证实酰基酶在纳米颗粒系统中未失活，且油墨和数字印刷过程未显著降低酶活性。

### 生物相容性评估

纳米颗粒印刷抗菌织物的潜在毒性在人皮肤成纤维细胞和角质形成细胞上进行测试。3天孵育后，alamarBlue检测显示原棉和印刷纺织品处理样品间细胞活力无差异，荧光显微镜观察显示两种织物上皮肤细胞密度、形态、大小和活力均相当。这种低毒性归因于生物聚合物壳聚糖的掺入缓解了银纳米颗粒的细胞毒性效应，且5天后银累积释放量约0.67 ppm，低于报道的人皮肤细胞系毒性诱导水平。

## 讨论总结与结论翻译

结论部分指出，由持续生物膜形成和多重耐药病原体传播所驱动的感染管理日益严峻的挑战，凸显了创新抗菌策略的迫切需求。研究人员首次报道了将保留催化活性的QQ酶功能化纳米颗粒数字印刷到纺织品上的成功，赋予材料抗生物膜特性。数字印刷的AgCS@AC NP涂层织物展现出双模式抗菌机制，有效杀灭浮游铜绿假单胞菌的同时降解细菌QS分子，抑制毒力因子，阻止生物膜形成，并潜在减少选择压力。此外，生物聚合物和酶与银基纳米材料的整合产生了生物相容性杂化系统，对人皮肤成纤维细胞或角质形成细胞无细胞毒性效应。总体而言，这些发现凸显了通过数字印刷应用于纺织品的酶功能化涂层作为开发创新抗感染材料的多功能平台的前景。