《Analytica Chimica Acta》：High-Efficiency Cross-Linker TDS Enables Low-Input In Vivo Structural and Interactomic Analysis
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张贝蓉|夏宇|刘毅|钟博文|李晓|何英云|赵宝峰|梁振|张玉奎|赵群|张丽华中国科学院大连化学物理研究所国家色谱分析中心医学蛋白质组学国家重点实验室，中国辽宁省大连市中山路457号，邮编116023摘要体内化学交联质谱技术能够有效捕捉天然环境下的蛋白质-蛋白质相互作用及其动态变化
张贝蓉|夏宇|刘毅|钟博文|李晓|何英云|赵宝峰|梁振|张玉奎|赵群|张丽华
中国科学院大连化学物理研究所国家色谱分析中心医学蛋白质组学国家重点实验室，中国辽宁省大连市中山路457号，邮编116023
摘要
体内化学交联质谱技术能够有效捕捉天然环境下的蛋白质-蛋白质相互作用及其动态变化，但由于其对样本量要求较高（通常需要E7–E8级细胞数量），难以应用于稀有细胞群体。为解决这一问题，我们开发了一种低样本量的体内XL-MS分析策略，该策略将微型化、无需转移的一锅法流程与TDS（海藻糖琥珀酰亚胺酯）交联剂相结合。TDS具有优异的生物相容性和膜通透性，能够在最小程度干扰细胞功能的情况下实现高效的体内交联。更重要的是，TDS可被质谱仪分解，在碎裂过程中会产生有用的碎片离子，从而简化数据检索过程，相比不可分解交联剂所带来的二次方复杂度，显著提升了检测灵敏度。此外，TDS还具备与液相质谱仪的良好兼容性，可在整个分析过程中保持稳定，无需中间清理步骤，使得该流程非常适合低样本量分析应用。通过这一策略，我们从仅1E3个细胞中就揭示出了由273种蛋白质通过1,055种独特交联键连接而成的复杂相互作用网络。这一成果有效弥补了低样本量限制与高分辨率细胞结构分析之间的差距。我们以低样本量样本中的组蛋白H3.2的构象动态为例，展示了该技术的应用能力。总体而言，该方法为从微量生物样本中解析相互作用网络提供了可靠的平台。
引言
生物系统具有极高的异质性，这种特性决定了它们的功能多样性以及适应动态环境的能力[1]，[2]。要理解这种复杂性，尤其是探究蛋白质-蛋白质相互作用在自然状态下的表现，对于了解正常生理功能以及疾病的分子机制至关重要[3]，[4]。
体内化学交联质谱技术能够通过共价键捕获空间上邻近的氨基酸残基，从而保留蛋白质-蛋白质相互作用的天然状态，并有助于以结构分辨率绘制全蛋白组的相互作用网络图[5]，[6]。尽管该技术具有诸多优势，但现有的大多数分析方案都需要大量的初始样本，通常是E7到E8级的哺乳动物细胞[7]，[8]。之所以需要如此大量的样本，不仅是因为在多步骤处理过程中会存在样本损失（如细胞裂解、蛋白质提取、消化和富集等），更是因为交联肽本身具有极低的丰度（仅占总消化产物的0.1%–0.5%）、更高的疏水性以及复杂的碎裂模式。这些因素再加上线性肽带来的严重光谱干扰，以及由此导致的数据库搜索空间的二次方级扩展，都大大降低了检测的灵敏度。因此，这些技术障碍限制了XL-MS技术在那些样本量本就有限的稀有或异质细胞群体中的应用。
在样本制备技术方面的进步，尤其是在富集策略方面的发展，显著降低了XL-MS分析所需的细胞数量[9]，[10]。近期的一项重要进展是一步式富集交联剂DPST：其二甲基哌啶基结构能够通过TMT抗体直接富集交联肽，避免了多步骤富集过程中的样本损失，使得仅需1E4个细胞就能识别出大约141个交联位点——这是迄今为止报道的体内化学交联实验中最低的细胞需求量。除了以富集为核心的分析流程存在的局限性之外，微量水平XL-MS分析面临的另一个主要瓶颈是在上游处理过程中由于非特异性吸附和降解导致微量分析物的大量损失。在体内交联之后，还需要进行细胞裂解、蛋白质提取和酶促消化等一系列操作，这些步骤都需要反复转移样本。随着初始样本量的减少，这些累积的损失便成为主要的限制因素，使得以富集为核心的优化方法无法满足低样本量分析的需求。
由于交联肽的丰度极低，即使是微小的表面吸附也会导致其大量丢失，从而在富集之前就严重限制了检测的灵敏度[12]。这一问题极大地影响了低样本量分析的检测覆盖范围和数据可靠性。为解决这一问题，借鉴微量蛋白质组学中的有效策略十分必要：微型化的一锅法流程可以通过整合多个步骤来减少样本与表面的接触机会[13]；而像正十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM）这样的与质谱仪兼容的表面活性剂，则可以有效抑制样本处理过程中的非特异性吸附[14]。然而，仅仅克服上述“上游损失”还不够。为了解决数据库搜索空间二次方级扩展的问题，这些工程学上的改进还需要与化学改良方法相结合。使用具有更高反应活性和更好碎裂特性的交联剂，对于提升肽段的可识别性至关重要，这样才能确保那些少量检测到的交联肽段能够被准确识别，并从复杂的背景信号中区分出来。
在此，我们提出了一种应对这些挑战的策略。我们采用以海藻糖琥珀酰亚胺酯（TDS）为核心的协同策略[15]。TDS兼具高膜通透性和优异的生物相容性，这使得它能够高效地实现体内交联，同时将对细胞的干扰降至最低。更重要的是，TDS具有可被质谱仪分解的特性，这不仅简化了数据分析过程，还提升了检测灵敏度。为了充分利用这些优点，我们开发了一种微型化、集成化的一锅法流程，该流程能够在无需中间清理步骤的情况下完成体内交联、细胞裂解和蛋白质消化等操作。这种无缝集成方式避免了因反复转移样本而产生的非特异性吸附问题，从而保留了那些微量存在的交联肽段。通过应用这一集成化平台，我们仅从1E3个HeLa细胞中就成功识别出了蛋白质-蛋白质相互作用，为稀有细胞蛋白质组学研究建立了可靠的分析范式，其检测下限甚至可达到100个细胞。因此，我们的方法为在生物样本中检测低丰度蛋白质的细胞内相互作用提供了一种灵敏且可靠的解决方案。
章节节选
TDS的质谱兼容性评估
质量控制样本被溶解在0.1%甲酸水溶液中，浓度调整为0.25 μg/μL。随后加入TDS[15]或BS3交联剂，最终浓度为3 mM——这是我们优化后的流程中使用的最高浓度——然后进行涡旋混合，之后再通过液相质谱/质谱仪对混合液进行分析。质量控制样本的详细制备步骤见补充信息部分。
不同细胞数量条件下交联剂浓度的优化
含有1E5、1E4或1E3个细胞的细胞沉淀分别被
低样本量体内XL-MS分析策略的构建
传统的体内XL-MS分析流程通常需要大量的初始样本（E7–E8级哺乳动物细胞），因此并不适合低样本量蛋白质组学分析。为解决这一限制，我们开发了一种专为低样本量体内XL-MS分析设计的简化流程（见图1A）。我们方法的一个关键创新在于采用了完全集成的一锅法流程，即在同一个反应容器中依次完成体内交联、淬灭、细胞裂解和蛋白质消化等操作。这样
结论
在本研究中，我们提出了一种具有革命性的低样本量体内XL-MS分析策略，它大幅提升了结构蛋白质组学分析的灵敏度极限。该平台的成功得益于微型化一锅法流程与经过精心设计的TDS交联剂之间的协同作用。TDS不仅具有优异的生物相容性和膜通透性，能够高效实现体内交联，还具备出色的与液相质谱仪的兼容性，可在整个分析过程中保持稳定，从而无需进行可能影响分析结果的中间清理步骤
利益冲突声明
作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知利益冲突或个人关系。
CRediT作者贡献说明
张贝蓉：写作——审阅与编辑，写作——初稿撰写，可视化分析，实验研究。张丽华：项目管理，资金获取，概念构思。赵群：项目管理，概念构思。张玉奎：监督，方法设计。梁振：监督，方法设计。赵宝峰：监督。何英云：资源提供，方法设计。李晓：概念构思。钟博文：资源提供，方法设计。刘毅：实验研究。夏宇：写作——审阅与编辑，
利益冲突声明
作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知利益冲突或个人关系。
致谢
本研究得到了非传染性疾病国家科技重大专项（2026ZD0557201）、中国国家重点研发计划（2021YFA1302604，2024YFC3405403）、国家自然科学基金（22322411，22274150，22393931，22494700）、辽宁省振兴人才计划（XLYC2202034，XLYC2403154）以及大连市杰出青年科学家基金（2024RJ009）的支持。
