Remodelin处理重塑实验性丘脑出血后炎症相关转录组特征

《Frontiers in Genetics》：Remodelin treatment reshapes inflammation-related transcriptomic signatures in experimental thalamic hemorrhage

　　

背景：丘脑出血（Thalamic Hemorrhage, TH）是脑出血（Intracerebral Hemorrhage, ICH）的一种严重亚型，继发性神经炎症参与组织损伤和神经功能恶化。N-乙酰转移酶10（N-acetyltransferase 10, NAT10）作为RNA N⁴-乙酰胞苷（ac⁴C） writers，已被报道参与炎症调控和神经系统疾病。然而，Remodelin处理后丘脑出血的炎症相关转录组变化尚不清楚。方法：研究人员对对照组、丘脑出血模型组和Remodelin处理组小鼠的病灶周围丘脑组织进行了mRNA转录组测序。在模型组与对照组、Remodelin干预组与模型组比较中鉴定差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs）。在两个比较中呈现相反调控方向的基因被定义为Remodelin逆转差异表达基因。将GeneCards来源的炎症相关基因转换为小鼠直系同源基因并与Remodelin逆转基因取交集。随后进行蛋白-蛋白相互作用分析、基因本体论（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集分析、基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）、免疫细胞特征估计以及转录因子/miRNA调控网络预测。通过定量RT-PCR（quantitative RT-PCR, qRT-PCR）验证关键候选基因。结果：RNA-seq鉴定出模型组与对照组比较中有499个差异表达基因，Remodelin干预组与模型组比较中有664个差异表达基因。在46个共享差异表达基因中，42个呈现相反方向调控。经直系同源校正筛选后鉴定出9个Remodelin逆转炎症相关候选基因：Cxcl1、Ccl2、Ncf4、Ptx3、Pomc、Masp2、Tnfrsf8、Card9和Gpr84。富集分析显示这些基因主要与白细胞和中性粒细胞介导的免疫、肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor, TNF）产生、细胞因子-细胞因子受体相互作用、IL-17信号通路、TNF信号通路、趋化因子信号通路和NOD样受体信号通路相关。蛋白-蛋白相互作用分析突出显示Ccl2、Cxcl1和Pomc为主要候选节点。qRT-PCR使用独立生物学样本为Remodelin相关Cxcl1和Pomc表达变化提供了初步转录水平支持，而Ccl2在出血后增加但Remodelin未显著降低其表达。结论：本研究鉴定了实验性丘脑出血中Remodelin逆转的炎症相关转录组特征。Cxcl1和Pomc代表最受支持的Remodelin响应性转录组候选基因，而Ccl2似乎是一个在检测时间点未发生稳健逆转的出血相关炎症枢纽基因。这些发现为研究Remodelin治疗相关的炎症相关转录重塑提供了探索性神经基因组学框架。

研究背景与问题

丘脑出血是指脑室周围丘脑区域血管破裂所致的疾病，以突发头痛、意识障碍和神经系统症状为特征，占脑出血的10%–15%，且常破入脑室，导致高死亡率和高致残率。高血压、动脉粥样硬化等血管疾病患者及高龄人群更易发生。患者常出现失语、单侧忽视、记忆障碍等认知功能障碍，以及运动麻痹和感觉障碍，严重影响日常生活能力。由于其解剖位置深在，丘脑出血难以通过手术清除，目前理想治疗方案尚未确立，亟需探索新方法。

除初始占位效应和机械性组织破坏外，脑出血可诱导 resident 神经细胞和浸润免疫细胞发生快速的转录、表观遗传和表观转录组重编程，这些调控过程可能决定出血后炎症的程度和持续时间，因而代表潜在治疗靶点。NAT10是唯一已确定的哺乳动物ac⁴C writers，该RNA修饰可增强mRNA稳定性和翻译效率。NAT10/ac⁴C调控异常已与病毒RNA稳定性、心血管损伤和神经系统疾病相关。炎症机制在脑出血中具有重要作用，出血触发涉及驻留胶质细胞和招募 {#a1}

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招募白细胞的局部和全身炎症反应，导致水肿、血脑屏障破坏和继发性神经元损伤。研究表明NAT10敲低可减少脂多糖诱导的巨噬细胞炎症信号，而Remodelin作为一种NAT10靶向小分子化合物，值得在丘脑出血后评估其炎症转录变化。

研究方法概述

研究人员采用C57BL/6小鼠立体定向注射胶原酶（Collagenase IV）诱导丘脑出血模型，设置对照组（sterile saline注射）、模型组及Remodelin干预组（5 mg/kg腹腔注射，首日后开始，每周两次，共6次），末次注射后约72 h收集病灶周围丘脑组织进行mRNA转录组测序（Illumina NovaSeq 6000平台）。研究还纳入GeneCards数据库来源的1,024个人类炎症相关基因，转换为小鼠直系同源基因后用于后续分析。主要技术方法包括：DESeq2进行差异表达分析（nominal p < 0.05且|log₂FoldChange| > 0.5）；STRING数据库进行蛋白-蛋白相互作用分析并用Cytoscape及MCODE插件可视化；clusterProfiler进行GO和KEGG富集分析；GSEA基于m2.cp.v2023.1.m.symbols.gmt参考基因集；CIBERSORT算法估算25种免疫细胞浸润丰度；TRRUST v2数据库和miRNet 2.0分别预测转录因子和miRNA调控网络；最后用独立生物学样本（n=3/组）进行qRT-PCR验证。

研究结果

3.1 Remodelin逆转丘脑出血后部分转录组改变

PCA显示三组样本可见分离，PC1和PC2分别解释61%和15%的总方差。模型组与对照组比较鉴定出499个差异表达基因（315个上调，184个下调），干预组与模型组比较鉴定出664个差异表达基因（345个上调，319个下调），表明出血和Remodelin均引起显著转录组改变。在46个共享差异表达基因中，42个呈现相反方向调控，被定义为Remodelin逆转差异表达基因。热图显示两大表达模式：一组在模型组升高、干预后降低；另一组在模型组降低、干预后恢复。

3.2 直系同源校正筛选鉴定Remodelin逆转炎症相关基因

将GeneCards来源的小鼠直系同源炎症基因与Remodelin逆转差异表达基因取交集，鉴定出9个候选基因：Cxcl1、Ccl2、Ncf4、Ptx3、Pomc、Masp2、Tnfrsf8、Card9和Gpr84。其中Cxcl1、Ccl2、Ncf4、Ptx3在模型组上调而干预后降低；Pomc、Masp2、Tnfrsf8、Card9、Gpr84则相反。双log₂FC图显示Cxcl1模型诱导上调最明显、Pomc呈现清晰的领航性模型降低/干预升高模式。蛋白-蛋白相互作用网络中Ccl2、Cxcl1和Pomc为突出节点。GO富集提示这些基因主要关联白细胞介导免疫、中性粒细胞介导免疫、细胞杀伤、TNF产生及霾S基；KEGG分析链接至NOD样受体信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、IL-17信号通路、TNF信号通路和趋化因子信号通路。

3.3 关键基因在免疫炎症相关通路中发挥重要作用

GSEA分析显示：对照组vs模型组中，Ccl2富集于α-防御素、清道夫 receptors配体结合与摄取等通路；Cxcl1富集于α-防御素及清道夫 receptors配体结合与摄取通路；Pomc参与α-防御素及游离40S亚基池形成通路。模型组vs干预组中，Ccl2富集于α-防御素和细胞外基质组织通路；Cxcl1主要参与α-防御素通路；Pomc富集于α-防御素和清道夫 receptors配体结合与摄取通路。这些结果表明关键基因主要与免疫炎症相关信号通路有关。

3.4 关键炎症相关基因的免疫浸润与调控网络分析

CIBERSORT估算25种免疫细胞类型，Kruskal检验显示M1巨噬细胞和调节性T细胞（Tregs）在三组间存在显著差异。相关性分析显示Ccl2与Treg丰度呈负相关。转录因子预测鉴定出25个与Cxcl1、Ccl2、Pomc相关的潜在转录因子，形成Cxcl1-Jun、Ccl2-Rel、Pomc-Fos等调控配对。miRNA预测鉴定出23个靶向关键基因的潜在miRNA，包括mmu-let-7f-5p-Ccl2、mmu-let-7f-5p-Cxcl1、mmu-mir-375-3p-Pomc等配对。

3.5 关键基因表达验证

qRT-PCR分析显示：与对照组相比，模型组Ccl2和Cxcl1显著升高，Pomc显著降低；Remodelin干预后Pomc升高、Cxcl1降低，但Ccl2在模型组与干预组间无显著差异。该结果支持Cxcl1和Pomc作为Remodelin响应性转录候选基因，而Ccl2应被解释为在检测时间点未发生稳健逆转的出血相关炎症枢纽。

讨论与结论

本研究通过整合RNA-seq、直系同源校正炎症基因筛选、蛋白-蛋白相互作用、通路富集、免疫细胞浸润估计、调控网络预测及初步qRT-PCR评估，鉴定了Remodelin逆转的炎症基因特征。主要概念性启示在于Remodelin可能通过转录组重塑影响出血后炎症。NAT10介导的RNA调控可能代表炎症上游调控层次，既往研究显示NAT10可通过NOX2-ROS-NF-κB通路促进巨噬细胞炎症激活，而Remodelin作为NAT10抑制剂可减轻炎症反应。

研究团队的近期工作进一步支持Remodelin-NAT10/ac⁴C轴在丘脑出血中的生物学合理性，该工作通过ac⁴C斑点杂交检测NAT10活性/ac⁴C修饰，免疫组织化学评估NAT10蛋白表达，证实丘脑出血增加ac⁴C修饰mRNA水平并上调NAT10蛋白表达，而Remodelin处理降低ac⁴C丰度并抑制NAT10表达，行为学、组织学和分子评估确认NAT10抑制减轻丘脑出血诱导损伤。

直系同源校正策略增强了炎症特征的生物学相关性。9个候选基因主要涉及白细胞/中性粒细胞介导免疫、细胞因子和趋化因子信号、TNF相关炎症反应及先天免疫通路，与脑出血icts体出血后继发性炎症损伤的已知机制高度一致。其中Cxcl1具有一致的表达模式，该CXC趋化因子与中性粒细胞招募和早期炎性细胞 trafficking 密切相关，其逆转提示Remodelin可能减弱出血丘脑的急性趋化因子驱动炎症招募。Pomc的恢复可能提示神经免疫或神经内分泌调节程序的部分恢复，黑色素皮质素信号已涉及炎症控制。相比之下，Ccl2虽在RNA-seq和网络分析中表现突出，但qRT-PCR未支持其显著逆转，应谨慎解读为不完全验证的Remodelin逆转转录本。

免疫浸润分析提示Remodelin相关转录重塑可能与免疫微环境变化相关。预测性调控网络提供了Cxcl1-Jun、Ccl2-Rel、Pomc-Fos等转录因子-基因配对，以及mmu-let-7f-5p-Ccl2、mmu-let-7f-5p-Cxcl1、mmu-mir-375-3p-Pomc等miRNA-基因相互作用，提示炎症转录本丰度可能受转录激活、RNA稳定性、翻译效率、miRNA调控和表观转录组修饰共同 matters 塑造。

研究结论指出：本研究鉴定了实验性丘脑出血中Remodelin逆转的炎症相关转录组特征，并提供了理解Remodelin处理如何重塑出血后炎症程序的神经基因组学框架。Cxcl1和Pomc作为最受支持的Remodelin响应性转录组候选基因出现，而Ccl2可能是检测时间点未发生 robust 转录逆转的出血相关炎症枢纽。这些发现为NAT10相关RNA调控机制生成了假设，但并未确立NAT10/ac⁴C对所鉴定转录本的直接依赖性调控。