对蟋蟀生物钟中表达周期基因与非周期基因的敲除分析，以及基于EGFP的这些基因表达细胞的可视化研究

《Zoological Letters》：Knockout analysis of period and timeless and EGFP-based visualization of per-expressing clock cells in the cricket circadian clock

　　

摘要

在本研究中，我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，制造出了period（per）或timeless（tim）基因被敲除的蟋蟀。此外，我们还发现了一种天然存在的per^-突变体，该突变体缺少包含PAS结构域的大段编码区域。为探究可能的协同效应，我们对per^-突变体蟋蟀进行基因编辑，从而得到了per^-和tim^KO的双突变体。在持续黑暗条件下，tim^KO突变体蟋蟀的运动节律自由运行周期为23.06?±?0.20小时（均值±标准差），这一数值明显短于亲本品系的23.78?±?0.12小时。相比之下，per^KO和per^-突变体蟋蟀在转入持续黑暗环境后的头两到三周内表现出无规律的运动节律，但随后出现了具有一个或多个成分的复杂节律模式，其自由运行周期明显更长，为33.35?±?10.72小时。在per^-；tim^KO双突变体中，大约60%的个体出现无规律运动节律，而剩余40%的个体在持续黑暗条件下则表现出自由运行周期极长的复杂节律模式（37.0?±?9.17小时）。这些结果表明，存在一种独立的振荡机制，能够独立于传统的per/tim反馈回路来调节运动节律。此外，我们还在per^?背景上通过将egfp基因敲入per基因的第1外显子，构建了报告基因载体，以便通过egfp的表达来反映per基因的转录情况。在视叶内的三个不同细胞群中检测到了EGFP的表达：两个位于神经层与髓质神经细胞之间的背侧和腹侧边界处，另一个则位于辅助髓质附近。这些发现表明，这些细胞可能属于调控昼夜运动节律的生物钟网络的一部分。