综述：阐明音猬因子、成纤维细胞生长因子、Wnt/β信号通路对神经退行性疾病中CRMP2调控激酶的联系

《Beni-Suef University Journal of Basic and Applied Sciences》：Elucidate the nexus between sonic hedgehog, fibroblast growth factor, Wnt/beta signalling on regulatory kinases for CRMP2 in neurodegenerative disorders

　　

背景：神经退行性疾病（NDD）是一组异质性的神经系统疾病，其特征是进行性神经元丢失，导致大脑和脊髓内神经元死亡。这种突然的神经元连接导致多种神经退行性疾病的发展，包括痴呆、阿尔茨海默病、亨廷顿病、多发性硬化症、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症（ALS）、额颞叶痴呆（FTD）和皮克病。主体：神经退行性疾病的临床表现，包括认知下降、运动功能障碍和行为改变，可能在神经元丢失变得明显之前出现。这种相关性是复杂的，因为症状可以在任何特定类型的神经元丢失之前出现，并且其他一些因素如炎症可能在神经症状的进展中起潜在作用。多种触发因素，包括年龄、遗传、生活方式和环境因素，有助于建立一个对神经元寿命有害的环境。因此，研究人员预期在不久的将来会出现惊人的病例数量。本文的主要目的是强调主要负责神经退行性疾病病理生理学的基本分子和细胞通路。为了实现这一目标，研究人员对包括PubMed、Google Scholar和Research Gate在内的多个数据库进行了全面的文献综述。研究结果表明，多种信号通路调节多种激酶，包括糖原合酶激酶-3β（GSK3β）、细胞周期蛋白依赖性激酶5（CDK5）和Rho相关激酶（ROCK），这些激酶磷酸化CRMP2并损害神经元极性和轴突生长。结论：研究人员假设，抑制GSK3β和CDK5可能减少CRMP2的过度磷酸化，而CRMP2的过度磷酸化受到上游信号网络（包括Wnt/β-catenin、Shh、FGF和JAK/STAT）调节的激酶活性控制。临床试验编号：不适用。

**1 Introduction**
当前人类社会面临全球范围内广泛的精神疾病案例，这些疾病是当今主要关注点之一。精神疾病指那些以异常方式失去感觉、行为和情绪控制，导致痛苦并影响日常活动的个体。脑相关疾病分为神经发育障碍和神经退行性疾病，前者涉及大脑发育过程中神经元回路形成异常，后者则表现为已建立神经元回路的衰退。抑郁症、注意力缺陷多动障碍、帕金森病、阿尔茨海默病、精神分裂症和强迫症（OCD）等神经系统疾病对全球经济造成高影响生物负担。为深入理解这些疾病的病理生理学，已有多种假说解释其起源和进展，但主要致病因素或通路仍未阐明。多项研究发现CRMP在进展性神经系统疾病的病因学中发挥关键功能。CRMP是一种胞质蛋白，存在5种形式（CRMP1-5），分子量60-66 kDa，约564-572个氨基酸，小鼠与人类之间具有95%的结构相似性。五种CRMP形式间有75%相似性，而CRMP5与其他形式仅有约50-51%相似性。CRMP以异源四聚体和同源四聚体构型存在，其N端活性位点位于蛋白复合物外侧，为多种胞质因子提供结合位点。CRMP蛋白在神经元中高表达，负责通过跟随生长锥导向、生长锥塌陷和轴突形成来发育神经元网络。CRMP蛋白也对神经元产生负面影响，导致变性并引发神经系统疾病，如帕金森病、精神分裂症、注意力缺陷多动障碍、阿尔茨海默病和肌萎缩侧索硬化症（ALS）。此外，CRMP通过多种激酶通路激活，包括微管相关蛋白（MAP）、糖原合酶激酶（GSK）、Rho激酶（ROCK）和细胞周期蛋白依赖性激酶5（CDK5）。在秀丽隐杆线虫中，UNC-33（三个CRMP基因之一）的突变导致轴突发育受损。CRMP2的表面化学显示其大部分表面带负电荷，偶有中性或正电荷区域。一种可能机制表明，CRMP2表面的负电荷区域形成口袋，允许结合带正电荷的小分子，如羊毛硫氨酸酮亚胺（LK）及其5-乙酯（LKE）。拉科酰胺是另一种直接与CRMP2结合的小分子。利用CRMP2完整四聚体结构进行对接实验，发现LK和LKE有四个重复结合口袋，包括拉科酰胺口袋、bis-tris口袋、寡聚体口袋和双金属结合位点。即使结合口袋的微小构象变化也能直接影响配体的对接分数，提示不同小分子可能通过CRMP2表面的不同结合口袋与之结合。在神经元形成的早期阶段，有丝分裂后神经细胞中CRMP表达水平高，并随年龄增长逐渐下降。大脑发育阶段，每种CRMP显示出严格调控的独特时空表达模式。突触连接随神经元成熟持续生长，直接促进轴突扩展和神经元分化。成年脑中CRMP表达水平低于发育期，但在小脑、嗅球和海马等再生和可塑性关键区域得以维持。其中CRMP2在成年脑的有丝分裂后神经元中显著表达于小脑、嗅系统和海马；CRMP3 mRNA定位于小脑颗粒层、下橄榄核和海马齿状回。每千碱基每百万映射读数（RPKM）是量化脑区CRMP表达的成熟技术。近期研究表明，抗抑郁药物能短暂显著增加CRMP2表达；拉科酰胺和氯胺酮等分子直接结合CRMP2并发挥神经保护作用。大量文献证据显示CRMP参与发育性和神经系统疾病。大脑中CRMP主要负责在脑发育阶段提供神经元回路形成的骨架结构，并通过调节突触可塑性在成人大脑中发挥作用，因此CRMP表达水平的改变可能导致精神疾病。单核苷酸多态性（SNP）分析显示，CRMP1是精神分裂症和自闭症谱系障碍（ASD）患者突触可塑性改变的主要蛋白。CRMP1敲除动物模型实验显示过度活跃、认知障碍和惊跳反射前脉冲抑制，证明CRMP1参与精神分裂症。CRMP2缺失导致实验动物神经元发育缺陷和行为障碍。通过蛋白质组学技术分析，CRMP2在γ-氨基丁酸能系统、谷氨酸能突触和神经营养因子信号通路中的异常表达水平与精神分裂症相关。涉及CDK5、MAP和GSK3β的信号通路或CRMP活性中断可导致严重的发育性神经系统疾病。研究显示Sema3A和CRMP均上调并参与轴突生长和再生，导致神经损伤。CRMP还与多种神经系统疾病相关。在阿尔茨海默病（AD）患者中发现，CRMP的高度磷酸化形式是神经原纤维缠结（NFT）形成的关键组分。在过表达淀粉样前体蛋白（APP）细胞内结构域的转基因小鼠中，磷酸化CRMP2水平升高，可能由增强的GSK3β活性驱动。

**1.1 Molecular pathway for CRMP2 Hyperphosphorylation**
人体内存在多种触发因素，这些因素与其他受体、蛋白质和基因直接或间接交叉连接，因此识别神经系统疾病起源和进展的核心分子机制通路极具挑战。未磷酸化的CRMP2被认为对大脑的发育和成熟以及学习和记忆等功能至关重要，而其异常或过度磷酸化则对脑发育产生负面环境，导致多个脑区神经元丢失。多种激酶和蛋白作为催化剂参与未磷酸化CRMP2向磷酸化CRMP2的转化过程，包括GSK3β、CDK5等。这些激酶由多种信号通路触发和激活，如成纤维细胞生长因子（FGF）信号通路和音猬因子（Shh）通路。深入分子机制通路可揭示FGF信号通路、Shh通路、Wnt/β-连环蛋白（Wnt/β-catenin）、GSK3β、CDK5与CRMP2在神经发育和退行性疾病中的相关性。Shh通路是将信息传递至胚胎细胞以进行正确分化和发育的主要通路之一，也积极参与神经元发育、分化和脑内神经管形成。该通路的失调可能导致神经发育障碍和脑肿瘤。Shh与PTCH1结合激活Smoothened（SMO），进而启动Gli转录活性，其对Wnt/β-catenin和Akt的抑制效应并非直接或普遍确立。Wnt/β-catenin信号通路是用于多个脑区神经元增殖、分裂和迁移的关键通路。FGF信号通路负责多个阶段的大脑发育。FGF与其特异性受体结合后启动下游信号级联，主要通路包括RAS/RAF/MAPK、PI3K/AKT和PLc。Shh和FGF信号与PI3K/AKT通路存在背景依赖性关联：FGF常激活PI3K/AKT，而Shh可能间接调节该通路。Shh抑制Wnt/β-catenin下游的PI3K/AKT信号。研究证实Wnt信号、PI3K/Akt、RAS/RAF/MAPK通路负责抑制GSK3β。GSK3β的抑制可阻止CRMP2的过度磷酸化，进而防止神经元丢失、限制T细胞迁移并稳定微管动力学，同时促进神经发生和成熟，抑制神经原纤维缠结和淀粉样蛋白-β病理的发展。除上述调节GSK3β激活的信号级联外，FGF信号还通过另一下游级联激活CDK5。FGF负责激活MEK/ERK下游信号级联，导致激活蛋白（P35）与CDK5结合形成p35/CDK5复合物。该激酶对哺乳动物皮层神经元分化和成熟至关重要。在钙蛋白酶存在下，该激酶可裂解为p25/CDK5和p10复合物，变得不稳定并对神经元发育产生负面环境，同时导致CRMP2在Ser⁵²²位点的过度磷酸化。CRMP2的过度磷酸化随后导致微管动力学不稳定、神经元丢失、影响神经发生和成熟、T细胞迁移，以及淀粉样蛋白-β（Aβ）和神经原纤维缠结（NT）的产生。此外，它还导致氯离子细胞内通道4（CLIC4）蛋白密度增加，通过CLIC4丝氨酸108位点的磷酸化最终导致神经元中活性氧（ROS）的积累。这种氧化应激积累不仅导致神经元死亡，还抑制转化生长因子β1（TGFβ1）。正常情况下，TGFβ1激活AKT信号，进而抑制GSK3β并阻止CRMP2的过度磷酸化。

**1.2 GSK-3α/β and CRMPs**
GSK-3是一种多功能丝氨酸/苏氨酸激酶，由两种基因形式（GSK-3α和GSK-3β）产生，负责调控多种细胞和分子事件，如胰岛素信号、糖原代谢、细胞生长和分化。实验研究已提供GSK-3α/β失调与动脉粥样硬化、糖尿病、神经退行性疾病及多种恶性肿瘤的相关性。GSK-3β在大脑功能的多个维度（如突触形成、神经元形态、炎症和神经系统疾病）中发挥重要作用。GSK3对脑发育既有正面也有负面调节作用：抑制GSK3可促进生长锥微管组装，但也能阻断轴突生长。实验研究表明，GSK3的抑制能否促进或限制轴突生长取决于特定细胞环境中被磷酸化的下游底物类别。CRMP2是一种微管结合蛋白，是神经元网络形成中细胞骨架重塑的关键组分，在发育中海马、大脑皮层、小脑（包括浦肯野细胞）、嗅球及多个皮层下核团的轴突远端高表达。CRMP2由GSK3β激酶在Ser⁵¹⁸、Thr⁵⁰⁹和Thr⁵¹⁴位点磷酸化。GSK-3β介导的CRMP2磷酸化导致功能性抑制，降低其微管结合和轴突生长促进活性，从而抑制海马神经元的极性和轴突生长。多项实验研究支持GSK-3α/β与CRMP在神经系统疾病中的关联。2013年Tan等人的实验发现CRMP与GSK-3α/β在神经生长中的关系。GSK3β介导的CRMP2磷酸化导致CRMP2功能抑制，降低其微管结合和轴突生长促进活性。在帕金森病和阿尔茨海默病等神经退行性疾病中，树突神经元结构退化伴有GSK-3活性异常升高。因此，非磷酸化CRMP负责微管组装和轴突可塑性，而GSK3β磷酸化的CRMP则抑制轴突生长并降低神经元极性。多项科学研究已确定GSK-3与CRMP在ALS、多发性硬化症（MS）和孤独症等神经系统疾病中的显著相互作用，这些相互作用影响神经发育、轴突生长和神经退行性变。尽管针对MS的直接研究有限，但GSK-3和CRMP均与轴突变性和髓鞘再生相关，提示存在潜在联系。

**1.3 Cyclin-dependent kinase 5 and CRMP**
细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）是一个丝氨酸/苏氨酸激酶家族，调节中枢神经系统中神经元生长、分裂、增殖和轴突导向等关键机制，并在突触可塑性、细胞运动与黏附、细胞周期激活以及帕金森病、阿尔茨海默病、孤独症、MS和ALS等急慢性神经退行性变的病理生理中发挥重要作用。最初鉴定的细胞周期蛋白激酶为细胞分裂周期2（Cdc2），后因其与酵母裂殖激酶同源性高而命名为CDK1。目前已知人类有5个编码CDK样激酶的基因和21个编码CDK的基因。CDK通常由CDK激活激酶磷酸化特定T-loop，并在与特定细胞周期蛋白调节亚基结合后被激活。CDK5是CDK家族中的独特成员，虽具有显著序列同源性，但不能直接参与细胞周期或由细胞周期蛋白激活。CDK5广泛分布于多种器官，但在有丝分裂后神经元中活性极高，原因是其激活因子p35和p39在这些细胞中选择性表达。p39和p35缺乏正常保守的氨基酸序列，因此不同于细胞周期蛋白。在发育脑中，CDK5与p35/p39转录本的表达在时间和空间上重叠，直接结合后形成活性复合物并改变下游信号通路。CDK5主要在终末分化的神经元中激活，而非增殖细胞。在小鼠前脑发育中，CDK5表达和激酶活性从胚胎第15天（E15）逐渐增加，于E17达到峰值，此为神经细胞分化的关键时间窗。大鼠胚胎脑发育中CDK5表达模式类似，从E12至E18稳步升高，在出生后第7天（P7）达到峰值，并持续整个成熟期和老年期（至18个月）。CDK5分布于整个成年中枢神经系统，尤其在脑干、杏仁核、嗅球、海马、小脑和大脑皮层。大中尺寸神经元（如脊髓传出神经元、小脑浦肯野细胞、海马和皮层锥体细胞）通常含有较多CDK5。不同脑区CDK5活性分析显示，从出生后第14天（P14）至18个月的大鼠神经皮层、纹状体、海马和小脑中CDK5水平无显著差异。中枢神经系统发育过程中，CRMP2与微管蛋白的通信受常规调节。Semaphorin-3A（Sema3A）通过其受体plexin A（PlexA1-3）和neuropilin-1（NP-1）信号导致Rac1刺激，进而影响下游激酶并激活GSK3β，后者在Thr⁵¹⁴和Thr⁵⁰⁹位点磷酸化CRMP2，这是经典的CRMP2介导的生长锥塌陷通路。在GSK3β介导的CRMP2磷酸化之前，CDK5必须先磷酸化CRMP2的Ser⁵²²位点。这种CDK5“引发”是后续GSK3β介导的连续磷酸化级联所必需的，类似于tau蛋白磷酸化的情境。磷酸化CRMP2与微管蛋白异二聚体的亲和力降低，通过阻止轴突远端微管形成促进轴突回缩。另一方面，神经营养因子-3和脑源性神经营养因子（BDNF）通过PI3K/Akt级联抑制GSK-3β，从而降低CRMP2的pThr⁵⁰⁹/pThr⁵¹⁴水平，促进轴突形态发生。

**1.4 Rho kinase and CRMP**
Rho相关蛋白激酶（ROCK）是Rho GTP酶下游的丝氨酸/苏氨酸激酶。在亚家族成员中，Cdc42、RhoA和Rac1因其多功能特性而成为研究焦点。RhoA在生长、黏着斑扩展和应力纤维形成中发挥关键作用，负责调节细胞收缩性、黏附和迁移。ROCK是RhoA的下游信号效应器，是调控细胞骨架动力学的首要激酶。Rho激酶进一步分为两个亚型：ROCK1和ROCK2，均属于PKA、PKG和PKC丝氨酸/苏氨酸激酶家族（即AGC家族）。RhoA/Rho激酶通路负责调控收缩、凋亡、基因表达和运动性等微观生理机制。大量文献提供RhoA/Rho激酶通路与心血管疾病、阿尔茨海默病、多发性硬化症、脊髓损伤和亨廷顿病等疾病关联的强有力证据。CRMP-2是Rho激酶信号级联中最有前景的下游效应器之一。Rho激酶通路的激活导致CRMP-2在Thr⁵⁵⁵位点的磷酸化以及肌球蛋白轻链（MLC）的磷酸化，从而引起轴突生长停滞和生长锥塌陷。科学数据表明Rho激酶负责CRMP-2的磷酸化，因此能够抑制Rho激酶通路的物质可能通过抑制CRMP-2磷酸化而成为对抗多种神经系统疾病的潜在候选药物。

**2 Conclusion**
CRMP是直接或间接参与多种神经系统疾病的胞质蛋白，受主要信号级联（尤其是音猬因子、Wnt/β-连环蛋白信号通路和成纤维细胞生长因子）调控。这些通路相互关联，通过调节下游激酶（如GSK3β、CDK5和Rho激酶）发挥作用。这些激酶主要负责CRMP特定残基的过度磷酸化和构象改变，这些改变与神经退行性疾病相关。靶向GSK3β和CDK5等下游激酶可能成为调节神经退行性疾病中CRMP2磷酸化的潜在治疗策略。治疗方向可集中于选择性调节参与CRMP2磷酸化的特异性下游激酶。尽管CRMP在每种过程中确切贡献尚不完全清楚，但深入了解CRMP的功能可能为生理过程以及疾病病因提供重要理解。研究结果提示CRMP可能在促进旨在控制神经系统疾病的靶向方法中发挥潜在作用。