Bioloc3D：一种用于三维荧光元件定量及其共定位分析的自动化工具集

《BMC Methods》：Bioloc3D: an automated toolset to quantify fluorescent elements and their colocalizations in 3D

　　

近二十年来，先进成像技术与定量分析方法取得了显著进展；然而，三维生物元件的定量仍具挑战性。虽然近年来基于对象的方法已涌现用于分析多通道荧光图像中的信号强度与共定位，现有工具主要聚焦于二维分析。该方案介绍了Bioloc3D，一种完全开源的工具，旨在全栈范围内定量荧光标记并自动化统计分析。通过克服现有方法的局限性，Bioloc如果有人问我关于这篇论文的具体内容，我可以根据以上信息提供详细的解答。

3D提供了解决三维多标识元件间共定位定量工具缺乏问题的方案。Bioloc3D由两个不同组件构成。其一为ImageJ工具集Bioloc3D-Imaging（B3D-Img），用于从不同通道中分离荧光元件并识别三维共定位。其二为Bioloc3D-Plotting（B3D-Plt），一种基于Python的软件，可实现B3D-Img生成Excel文件的分析自动化。作为概念验证，该工具集被用于研究和比较前扣带皮层（ACC）与躯体感觉皮层（SSC）中的GABA能SOM/PV抑制性微环路。

三维多通道免疫标记轮廓的个体化常需处理大型数据集。为应对潜在计算局限性，B3D-Img提供了简化 yet 准确的分割方案，加速基于对象的共定位分析。虽然个体化依赖于阈值分割，信噪比（SNR）仍是影响定量时间的关键因素。为测试这一局限性，B3D-Img已在挑战性条件（如噪声与背景）下进行评估。该方案实现了共聚焦图像全栈数据集的高效自动化分析。此外，为便于数据处理，Bioloc3D工具集包含独立的B3D-Plt应用程序，可快速执行统计分析、汇总并绘制B3D-Img生成的数据。总体而言，Bioloc3D为三维基于对象的共定位大数据集定量分析提供了一种易获取的集成解决方案。

该研究背景源于高分辨率显微成像技术的快速发展使生物元件表征达到越来越小尺度，但其定量分析仍面临复杂挑战。近二十年来，荧光显微定量研究受限于二维平面，主要由于三维计算固有的各向异性（anisotropy）及内存过载等困难。尽管基于对象的三维显微方法已发展用于比较信号强度、识别细胞亚群及评估连接性，多通道荧光图像中观察到的共定位常被用于推断潜在相互作用。共定位从共现（co-occurrence）与相关（correlation）角度有不同含义：相关视角下，共定位指两种荧光信号强度相互依赖且在空间均匀分布；共现视角下，共定位仅由像素/体素的空间重叠或其空间变化相似性决定。鉴于该方案关注描述不同类型重叠片段且信号强度可能无关联的情况，故仅考虑共现关系。

当前三维荧光信号分析虽有进展，Vaa3D、LABKIT、3D-OC等工具可用于荧光轮廓的可视化与分割，但共定位元素定量解决方案仍有限且有待改进。商业软件虽提供表面或点状共定位等分割分析方法，但存在复杂性及可及性问题。开源替代方案中，JaCoP插件提供包括Pearson系数和Mander系数在内的广泛指标，Coloc 2可测量特定感兴趣区域（ROI）的共定位；EzColocalization引入基于对象的共定位方法；DIANA插件主要评估三维背景下的对象间距；SynQuant则限于突触样形状的检测。因此，现有工具主要提供信号相关性的完整分析，适用于亚细胞共定位或拓扑关系研究，明显缺乏能够在三维多通道中个体化免疫标记轮廓并精确定量这些轮廓间共定位数量的工具，且整组图像栈分析自动化尚属空白。

Bioloc3D旨在通过全栈共聚焦图像荧光标记定量及数据统计分析自动化来填补上述空白。作为完全开源、免费、用户友好的解决方案，该工具集设计为规避不必要复杂性和可及性问题的简化工具。

Bioloc3D由两个关键组件构成：Bioloc3D-Imaging（B3D-Img）为ImageJ工具集，用于从两个不同通道中个体化荧光元件并识别三维共定位，围绕多个插件构建，核心依赖3D Object Counter（3D-OC）插件进行三维对象计数并提供体积、平均灰度值等特征。该宏将采集数据编译为Excel电子表格，最小要求为双通道2张图像的8位深度堆栈，建议TIFF格式，体素深度推荐1μm。Bioloc3D-Plotting（B3D-Plt）为Python脚本转换的独立应用程序，自动化分析ImageJ工具生成的Excel文件，实现数据可视化与统计检验，输出包括各通道分析及共定位分析，提供元素数量、体积、平均灰度值、共定位数量、相互作用体积及共定位元素百分比等指标。

该工具集前扣带皮层（ACC）与躯体感觉皮层（SSC）样本队列来源于3只雄性和3只雌性C57BL6/J小鼠（12周龄，Janvier繁殖，法国），动物经4%异氟烷麻醉后腹腔注射Euthasol（30 mg/kg）深度麻醉，心脏灌注4%多聚甲醛（PFA），振动切片机制作30 μm厚冠状脑片（含ACC和SSC区域），-80°C保存于PBS-10%甘油-25%蔗糖冷冻保护液中。SOM、PV和突触素（SYN）经免疫组化检测：切片以PBS-4%正常山羊血清（NGS）-0.2%皂苷封闭1小时，然后加入豚鼠抗PV（1/8000）+兔抗SOM（1/1000）+小鼠抗SYN（1/400）及1% NGS的抗体混合物，室温过夜；PBS洗涤后，以含山羊抗豚鼠Alexa 488（1/500）、山羊抗兔Alexa 555+（1/500）及驴抗小鼠Alexa 647+（1/500）的二抗溶液孵育2小时。

**研究结果部分如下：**

**3D孤立通道对象定量**：各通道经分割后，采用3D-OC插件进行三维对象定量。阈值分割用于区分对象与背景，系统扫描将相邻切片近端对象体素归为单一对象（Obj-C），并筛选符合指定大小范围的对象，计算体积、积分密度和平均灰度值等统计量。"检查点"阶段通过3D Simple Segmentation插件进行简单分割以防止错误。提供简化分割选项以缩短噪声或大数据集的处理时间，但仅输出元素数量而无其他特征。

**3D共定位对象定量**：主通道定量完成后，若检测元素数≥1则进行共定位分析。通过Image Calculator对通道对象图执行"AND"运算隔离共定位体素，经检查点后以3D-OC量化共定位对象（Obj-Co）的数量与体积。继而以3D Intensity Measure插件计算各通道在共定位体素处的平均灰度值，将共定位对象图二值化处理。通过"Multiply"运算将主通道对象标签赋予重叠的共定位对象，以直方图分析统计各对象的共定位体素数，乘以体素尺寸得相互作用体积，数据导出至"C1xCo"和"C2xCo"标签页。

**附加功能：胞体计数与共定位验证**：基于普遍染色（如DAPI）在单向或双向主通道中进行胞体计数，通过最大z投影图像的形态学滤波和分水岭分割保留圆形元素，以Analyze particles计数，可输出胞体数量和平均面积。另一功能为附加通道共定位验证，通过3D Simple Segmentation生成附加标记对象图，与共定位对象图执行"AND"运算，以3D-OC分析输出，用于验证神经元亚群间的相互作用（如使用突触标记物）。

**B3D-Plt计算、绘图与统计分析**：该Python独立应用程序使用pandas、numpy、seaborn等库，通过customtkinter构建用户界面，实现Excel文件处理、变量计算、分析综合及图形生成。导入首个Excel文件后，提取"Stack_"表格的体积值，计算各条件下元素总数、总体积和平均体积、胞体数量及面积，以及共定位事件数量和平均接触体积。若使用第三通道验证，还测量初始通道共定位与第三通道共定位的数量、密度和平均体积。采用dabest包生成估计图（estimation plot），以蜂群图（swarm plot）展示所有数据点，并在独立轴上以bootstrap 95%置信区间展示效应量，通过5000次重采样逼近正态分布以实现非参数统计分析。输出图形按分析元素分5个文件夹组织，并生成"data_excel.xlsx"和"stat.xlsx"两个Excel文件汇总数据与统计结果。

**讨论部分总结**：B3D-Img ImageJ工具集适用于满足最低要求的任何荧光免疫染色方法，兼容原始图像和后处理图像，但后处理需对所有图像做出相同修改以防止分析偏倚。空间共定位基于严格光学限制，需注意生物学相关性解读，共聚焦分辨率限制可能产生假共定位，建议仅在侧向分辨率低于1μm时考虑共定位（对应20×物镜NA=0.4-0.5）。工具集提供简化图形用户界面（GUI）用于图像导入和参数输入，选定图像文件夹并设置参数后宏以全自动方式顺序处理各文件，无需用户干预或特定ROI选择；若需限制特定区域，需预先裁剪保存后通过UI加载。

处理时间受图像尺寸和计算机计算能力影响，简单分割选项可缩短ImageJ定量过程。信噪比（SNR）和信背比（SBR）为关键考量因素，细胞计数依赖阈值分割，建议最大化SNR和SBR以获得准确分析。该研究所用图像经NoiSee插件测量呈现低SNR和中等SBR，模拟显微数据分析中常见的挑战性条件，结果显示B3D-Imaging仍能及时完成处理。与手动识别共定位相比，自动宏估计可减少20倍处理时间（视数据集和机器配置而异），并提供更复杂的定量（体积、强度），通过标准化分析避免观察者间变异和偏倚。信号密度可能使个体对象分割复杂化，纳入普遍染色（如DAPI）可减轻潜在误计数。

B3D-Plt在数分钟内自动分析和绘制大量文件，为短时间内获得广泛数据评估提供显著优势。采用估计图进行稳健统计分析，清晰展示数据集、均值差异（Δ）及相应置信区间，并纳入采样误差曲线用于分布评估，增强结果可解释性。

该工具集已在三项独立研究中应用，定量啮齿类动物脑样本中的神经元群体或细胞器。首项研究量化小鼠霍乱毒素b（CTB）与岛叶神经元两种转录因子的共定位神经元，CTB作为逆行示踪剂用于识别尾状核与特定岛叶锥体神经元亚群的连接。第二项研究表征ATP13A2缺陷大鼠模型黑质注射AAV9-GFP-LC3-mCherry后的自噬活性，pH敏感GFP信号（自噬体腔内淬灭）可区分自噬体（GFP⁺和mCherry⁺）与自噬溶酶体（仅mCherry⁺），B3D分析通过测量总mCherry点密度及其与GFP信号的共定位，精确量化自噬体成熟，为评估该模型多巴胺能神经元自噬通量提供指标。第三项研究比较小鼠躯体感觉皮层（SSC）和前扣带皮层（ACC）中生长抑素（SOM）和 parvalbumin（PV）GABA能中间神经元的比例及其相互作用，初步结果揭示两区域在细胞数量和突触接触方面存在差异，可能解释其在感觉输入整合中的不同作用。

**研究结论**：研究者通过B3D分析工作流量化ACC和SSC中SOM和PV中间神经元的分布及相互作用，结果揭示两区域中间神经元组织和复杂相互作用存在显著差异。具体而言，PV中间神经元胞体数量和大小在两皮质区域间保持一致，但ACC区域PV染色密度较高，归因于分支数量增加。两亚群分析显示ACC中检测到的SOM和PV轮廓数量显著更高，提示该区域网络较SSC更密集。共定位分析显示ACC中SOM/PV共定位数量更高，但共定位大小在两区域间无变化；而同时显示突触素（SYN）染色的SOM/PV共定位约占总共现的1%，且在SSC中比例更高（ACC为0.10.04%，SSC为1.67%），提示SOM/PV相互作用虽在文献中被描述为突触性和突触外性，但在这两个区域主要为突触外性，这与SOM等神经肽能神经元的容积传递（volume transmission）概念一致。尤为重要的是，每个中间神经元轮廓的共定位位点平均数在ACC中更高，且SOM中间神经元与PV共定位的百分比在ACC中更高，反之亦然。这些结果展示了B3D在揭示参与不同过程神经微环路细节方面的潜力。