大肠杆菌菌株的代谢工程改造，用于体内磷酸化酶介导的二糖合成

《Microbial Cell Factories》：Metabolic engineering of Escherichia coli strains for the in vivo phosphorylase-mediated synthesis of disaccharides

　　

摘要

背景

通过逆向磷酸解途径酶法合成稀有二糖，是一种有望可持续生产用于人类健康与营养的高价值糖苷的途径。利用表达重组糖苷磷酸酶的微生物进行体内合成是一种颇具吸引力的策略，因为它可能克服传统化学和酶法方法存在的诸多限制。然而，要成功实现这一目标，就需要具备能够高效供应前体物质并重新分配碳流的特殊代谢体系。在大肠杆菌中，使磷酸转移酶系统（PTS）失活并删除pfkA基因，是一种有效的策略，它可以将糖的吸收与其同时发生的磷酸化过程分离，促进关键糖磷酸盐的积累，从而为寡糖的生产提供逆向生物合成路径。

结果

我们首先通过构建β-1,2-甘露二糖的生产体系来验证这一概念。表达异源渗透酶GalP后，即便在PTS?环境下，大肠杆菌也能以甘露糖为养分生长，同时甘露糖还能进入逆向生物合成途径。删除会促使细胞内积累葡萄糖1-磷酸（G1P）和甘露糖1-磷酸（M1P）的pfkA基因，再结合表达β-1,2-甘露糖苷磷酸酶，就能够直接从甘露糖合成β-1,2-甘露二糖。pfkA基因的删除显著提升了产品浓度（超过0.6克/升）和产量（最高可达每克甘露糖9%），这表明碳流被有效重新分配用于二糖的形成。此外，以甘油作为碳源和能源，并结合进一步的代谢工程改造，实现了生长与生产的部分分离，使甘露糖主要被用于产物合成，最终产量可达60%。同样的代谢体系还被用来通过分别表达β-甘露糖苷磷酸酶和层状二糖磷酸酶，以甘露糖和葡萄糖为底物，生产β-1,4-甘露二糖和层状二糖。

结论

本文报告了通过对大肠杆菌进行代谢工程改造，实现在体内由己糖合成具有不同糖苷键结构的寡糖的研究。这些结果体现了该平台在发酵生产非传统寡糖方面的模块化特性和高效性，同时也拓展了糖苷生物合成领域中代谢工程策略的应用范围。

图形摘要