《Journal of NeuroVirology》：Circadian-guided oncolytic virotherapy for glioblastoma
胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GBM）仍是最具侵袭性的致死性恶性肿瘤之一，标准治疗Stupp方案下的临床结局仍不理想。尽管溶瘤病毒（Oncolytic Virus, OV）疗法已成为机制独特且极具前景的治疗策略，但其临床获益常受限于显著的瘤内异质性及获得性耐药。本综述提出，将昼夜节律生物学整合至治疗方案可显著提升溶瘤病毒疗法的疗效，该范式被定义为“溶瘤昼夜病毒疗法”。近期证据表明，作为多种溶瘤病毒骨架的神经嗜性病毒的感染周期并非静态过程，而是受宿主昼夜节律钟的内在调控。基础研究显示，关键病毒进入受体（如单纯疱疹病毒1型（HSV-1）的Nectin-1及p75NTR）的表达呈现显著的昼夜振荡，该振荡由核心分子钟（尤其是BMAL1/CLOCK复合物）直接协调。此外，肿瘤免疫微环境与辅助化疗药物替莫唑胺的肿瘤细胞敏感性呈现同步的活性峰值，通常集中于早晨窗口期，该时段常与DNA修复酶（如O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT））的谷值重合。研究人员认为，将溶瘤病毒给药与上述最大受体密度窗口及强效免疫监视时段同步，可最大化肿瘤溶解效应，并促进“冷”肿瘤向免疫应答型“热”肿瘤微环境的转化。个性化昼夜节律生物标志物与数学模型的联合应用将为下一代精准神经肿瘤学治疗策略的核心支撑。
引言
胶质母细胞瘤是中枢神经系统最具侵袭性的原发性恶性肿瘤，其预后数十年来对医学进展呈显著抵抗性。当前标准治疗方案为最大安全范围手术切除联合Stupp方案（放疗联合替莫唑胺），患者中位总生存期仅为15-20个月。该治疗失败的核心驱动因素包括GBM显著的瘤内异质性、耐药的快速获得，以及以低T细胞浸润、M2样巨噬细胞与髓源性抑制细胞主导的免疫抑制性“冷”肿瘤微环境（TME）。在此背景下，免疫检查点抑制剂（ICIs）等常规免疫疗法在GBM患者中未能产生持久临床获益。溶瘤病毒疗法通过工程化改造病毒（如日本获批的HSV-1 G47Δ）选择性在恶性细胞内复制并裂解肿瘤细胞，释放肿瘤相关抗原（TAAs）与损伤相关分子模式（DAMPs），发挥原位疫苗效应，可能通过将免疫抑制性GBM微环境转化为免疫应答型“热”环境，招募细胞毒性T淋巴细胞并重编程局部先天免疫。尽管潜力显著，溶瘤病毒的临床应答仍存在不一致性，常受限于病毒进入、复制及宿主免疫状态波动的个体间差异。昼夜节律钟作为调控细胞生理与免疫功能的内源性24小时计时系统，在GBM中常发生失调以促进肿瘤进展与干性维持，但仍保留对DNA修复酶（如MGMT）及病毒进入受体（如Nectin-1）的节律性控制。同时，系统性免疫监视并非静态过程，白细胞迁移、树突状细胞成熟及T细胞效应功能的昼夜振荡决定了疫苗接种与免疫治疗的疗效。本综述提出“溶瘤昼夜病毒疗法”的范式转变，强调病毒溶瘤效应及后续免疫激活具有内在时间依赖性，通过整合昼夜节律谱分析与数学模型优化给药时机，可利用肿瘤最大脆弱窗口与免疫效能峰值，从静态治疗模型转向动态时间感知策略，为克服GBM难治性提供新方向。
胶质母细胞瘤中失调的分子钟
哺乳动物昼夜节律钟由进化保守的细胞自主型转录-翻译反馈环路（TTFLs）调控。核心环路由CLOCK（昼夜运动输出周期蛋白）与BMAL1（脑和肌肉ARNT样蛋白1，由ARNTL编码）异二聚体驱动，其结合靶基因启动子区的E-box元件，调控Period（PER1、PER2、PER3）与Cryptochrome（CRY1、CRY2）基因的节律性表达；PER与CRY蛋白积累后形成抑制复合物反馈抑制CLOCK:BMAL1活性，构成24小时循环。次级环路由CLOCK:BMAL1激活核受体REV-ERBα/β（抑制因子）与RORα/β/γ（激活因子）转录，二者竞争BMAL1启动子区的ROR结合元件（RORE），保障振荡的高振幅与稳定性。
在GBM中，该时序协调性被系统性破坏以支持恶性表型。“正支”基因CLOCK与BMAL1在高分级胶质瘤中持续过表达，发挥致癌驱动作用：CLOCK过表达通过组蛋白乙酰转移酶活性上调细胞周期蛋白A、B1、D1，并激活NF-κB通路；BMAL1/CLOCK复合物是胶质母细胞瘤干细胞（GSCs）存活的关键依赖，其耗竭可诱导p53依赖性凋亡并削弱GSCs干性，而对正常神经干细胞影响较小。此外，CLOCK:BMAL1复合物通过转录激活乳酸脱氢酶A（LDHA）、己糖激酶2（HK2）等糖酵解酶，促进GBM代谢重编程（Warburg效应），并支持膜生物合成所需的从头脂质合成。
“负支”PER与CRY家族常作为抑癌轴在成人GBM中被抑制，其低表达与高级别肿瘤及不良预后显著相关。PER2通过结合并稳定抑癌蛋白p53，阻止其经MDM2介导的蛋白酶体降解，连接分子钟与DNA损伤应答；PER基因下调促进GBM凋亡逃逸与基因组不稳定性累积。CRY2在GBM中频繁抑制，其缺失导致c-Myc癌信号通路过度激活——正常情况下CRY2与SCF-FBXL3泛素连接酶复合物协作靶向降解c-Myc。
综上，GBM分子钟失调全面调控治疗抵抗相关的核心生物学轴：BMAL1/CLOCK依赖性转录调控WEE1、Cyclin B1、CDK1，解除有丝分裂检查点，驱动不受控增殖；PER2除稳定p53外，还参与核苷酸切除修复支架功能，其抑制同时破坏凋亡与修复检查点；CRY2缺失导致c-Myc过度激活及SCF-FBXL3介导的蛋白酶体降解逃逸；CLOCK:BMAL1复合物通过LDHA、HK2转录激活驱动有氧糖酵解，并促进膜生物合成所需脂质合成；基质金属蛋白酶（MMPs）表达及上皮-间质转化可塑性受时钟依赖性调控，影响肿瘤侵袭。上述昼夜节律对GBM核心特征的全面调控表明，治疗时机并非药理学优化细节，而是肿瘤脆弱性的基本维度，是本研究的核心论证基础。
分子钟失调不仅限于肿瘤细胞，还主动塑造免疫抑制性TME。GBM细胞中过表达的CLOCK:BMAL1复合物通过OLFML3-HIF1α轴促进M2样肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）与髓源性抑制细胞（MDSCs）招募，驱动肿瘤血管生成并形成以T细胞耗竭与PD-L1高表达为特征的“冷”免疫景观。二者存在双向交互：TAMs分泌携带miR-7239-3p的外泌体进一步重编程肿瘤时钟，形成自我强化的时间失调与免疫逃逸循环，凸显时间感知治疗干预对阻断GBM进展时间基础的必要性。
节律依赖性病毒感染性
病毒生命周期的第一步——病毒粒子与宿主细胞表面受体结合——受宿主内源性计时系统的深度调控。近期在人类脑类器官中开展的Cleavage Under Targets and Tagmentation（CUT&Tag）高通量分析显示，核心时钟蛋白BMAL1在至少32种神经嗜性病毒受体（包括PDGFRA、AXL、ITGB1（整合素β1））的启动子区存在特异性结合峰。例如，Nectin-1（由PVRL1编码，介导HSV-1进入神经元的主要受体）的表达呈现由分子钟直接协调的显著节律振荡：BMAL1/CLOCK异二聚体直接结合NECTIN-1启动子区的E-box样基序，增强其转录活性，形成每日特定的细胞易感性高峰窗口。
部分受体受时钟正支直接调控，另一些则通过复杂的间接抑制回路调控。典型例子为狂犬病毒（RABV）利用的p75NTR受体：p75NTR mRNA水平与转录抑制因子REV-ERBα振荡同相，该调控由细胞周期调节因子E2F8介导——E2F8作为p75NTR的转录抑制因子，REV-ERBα节律性抑制E2F8表达，从而周期性解除对p75NTR的抑制，促进病毒进入。这种“抑制因子的抑制因子”机制表明，昼夜节律钟对病毒感染性的影响超越简单线性通路，涉及决定细胞表面时间景观的互锁反馈环路。
跨物种实验证据证实，感染时机显著影响病毒致病结局。小鼠模型中，HSV-1与HSV-2感染在休息期较活动期严重程度更低：预防HSV-2感染所需的阿昔洛韦剂量在活动期较休息期高4倍，反映Nectin-1受体的时钟依赖性密度差异。RABV在ZT12（小鼠活动期起始）感染较ZT0感染导致更高病毒载量与更严重脑炎，该现象归因于p75NTR的昼夜节律门控。上述发现提示，初始病毒“定植”对宿主内源性生物时间高度敏感。
对于以HSV-1等神经嗜性病毒为骨架的工程化溶瘤病毒（如G47Δ、G207），上述昼夜节律原理提供了变革性机遇。GBM细胞（尤其是GSCs）常保留功能性（尽管失调）分子钟，驱动相同进入受体的节律性表达。将溶瘤病毒给药与Nectin-1、CD155等受体表达峰值同步，可最大化初始感染率与瘤内播散效率。此外，替莫唑胺（TMZ）等标准治疗的时效性已在早晨BMAL1高峰与MGMT谷值时达到最佳，将溶瘤病毒整合至早晨“溶瘤昼夜病毒疗法”方案中，可协同增强直接病毒溶瘤效应与化疗敏感性。
该昼夜生物学原理不局限于HSV-1载体，可扩展至GBM中已获临床概念验证的广谱溶瘤病毒平台：DNX-2401（δ-24-RGD）溶瘤腺病毒通过工程化RGD-4c基序经αvβ3与αvβ5整合素进入细胞，其进入受体的核心亚基ITGB1已被证实携带BMAL1转录结合峰；MV-CEA溶瘤麻疹病毒利用GBM细胞高表达的CD46进入，其治疗反应与基线干扰素刺激基因（ISG）表达负相关，而干扰素信号本身具有昼夜节律调控特征；PVSRIPO脊髓灰质炎病毒-鼻病毒嵌合体靶向CD155受体，其临床应答的长尾生存模式与免疫介导机制一致，而CD155已被纳入溶瘤昼夜病毒疗法的节律相关性受体框架。上述临床验证平台为设计前瞻性、不同时机的溶瘤病毒干预试验提供了必要基础。
昼夜节律免疫学与肿瘤微环境
哺乳动物免疫系统是由昼夜节律计时系统（CTS）调控的高度动态网络。人类外周循环中几乎所有白细胞亚群的计数均呈现高振幅24小时振荡：总淋巴细胞在早晨（08:00-10:00）达谷值，凌晨（00:00-02:00）达峰。但免疫监视效率与细胞计数常呈反相位：未分化T细胞在睡眠期达峰，而作为抗肿瘤 cytotoxicity主要介质的效应T细胞与自然杀伤（NK）细胞，其活性与浸润潜能峰值出现在早晨至午后时段。该系统性节律在肿瘤免疫微环境（TIME）中得到镜像体现：CD8+T细胞与树突状细胞（DCs）的浸润严格受时钟控制的趋化信号（如CCR7、CXCR4的昼夜振荡）调控。
褪黑素作为昼夜节律免疫架构的关键内分泌转导因子，主要由松果体在暗期合成分泌，血清浓度在睡前2小时升高，02:00-04:00（CT16-CT20）达峰，黎明骤降。褪黑素通过淋巴细胞与NK细胞表达的MT1、MT2受体发挥直接免疫刺激效应：增强NK细胞 cytotoxicity、促进促炎与抗病毒细胞因子（IL-2、IL-12、IFN-γ）产生、增强T细胞效应应答。这种夜间免疫 priming功能与本研究提出的早晨溶瘤昼夜病毒疗法窗口互补：夜间褪黑素介导的NK与T细胞 priming，衔接早晨皮质醇驱动的效应免疫细胞部署与DC成熟，形成连续的两阶段昼夜免疫准备模型。夜间药物性褪黑素补充是否可放大早晨免疫效应窗口、增强溶瘤病毒诱导抗原释放的疫苗样效应，仍是待验证的临床假说。
GBM以“冷”且深度免疫抑制的TME为特征，TAMs与小胶质细胞占比可达50%。肿瘤细胞与髓系细胞的分子钟在维持该状态中起决定性作用：GBM细胞中CLOCK:BMAL1复合物直接激活趋化因子OLFML3转录，通过HIF1α/LGMN轴招募小胶质细胞并将其重编程为促肿瘤M2样表型。反之，TAMs中BMAL1缺陷可增加活性氧（ROS）水平并使其向免疫抑制状态倾斜，凸显时钟完整性对“热”TME的必要性。此外，GBM细胞可通过远端与局部重布线节律：肿瘤重编程的小胶质细胞分泌含miR-7239-3p的外泌体，反馈至肿瘤下调BMAL1、上调CLOCK，形成自我维持的时间失调与免疫逃逸循环。
溶瘤病毒作为原位疫苗的疗效依赖于肿瘤相关抗原的有效提呈与免疫检查点的解除。研究显示，DC成熟及其向肿瘤引流淋巴结的迁移在特定每日窗口达峰，该过程由BMAL1依赖性CD80表达驱动。小鼠模型中，T细胞介导的抗原应答强度在白天（人类主观早晨）显著更高，该时段调节性T细胞（Tregs）抑制功能较低。关键的是，T细胞PD-1与肿瘤细胞PD-L1等免疫检查点的表达并非恒定，而是呈现显著的昼夜振荡。在早晨PD-1/PD-L1相互作用谷值期给药，理论上可最大化免疫系统再激活效应及病毒诱导的细胞毒性播散。
溶瘤病毒疗法（如oHSV-1 G47Δ）通过触发免疫原性肿瘤细胞死亡，释放DAMPs与TAAs重塑TME，涉及骨髓来源的抗肿瘤淋巴细胞招募及 resident小胶质细胞的特异性激活。若溶瘤病毒诱导的炎症刺激发生在昼夜免疫“静息期”（如下午/傍晚），免疫招募可能欠佳或被傍晚高水平的免疫抑制因子快速压制。将溶瘤病毒给药与早晨效应T细胞功能峰值及DC警觉性窗口对齐，可利用已 priming的免疫系统放大病毒的“疫苗效应”。这种将昼夜节律免疫学整合至溶瘤病毒方案的“溶瘤昼夜病毒疗法”，旨在宿主生物学上已准备好维持强效抗肿瘤攻击的时点，将GBM微环境转化为“热”免疫状态。
临床昼夜疗法的经验借鉴
神经肿瘤学中临床昼夜疗法的最有力证据来自替莫唑胺（TMZ）的应用。TMZ因吸收迅速、可穿透血脑屏障、半衰期短（约1.8小时）成为昼夜治疗调度的理想候选药物。一项纳入166例GBM患者的回顾性研究显示，与晚间给药相比，早晨TMZ给药与MGMT甲基化患者总生存期延长6个月相关。该生存获益的机制锚定于MGMT酶的昼夜节律调控：临床前模型显示，GBM对TMZ诱导凋亡的敏感性在BMAL1每日表达峰值时最高，该时段恰与MGMT活性谷值重合。此外，人活检标本中MGMT启动子甲基化的数学模型显示，甲基化检出概率在中午前后达峰，提示“最佳”诊断与治疗窗口具有内在时间依赖性。但前瞻性试验（如CENTRIC与CORE试验）结果存在争议，未发现总生存期获益，但观察到早晨组骨髓毒性增加。这种差异凸显关键教训：若患者内源性昼夜节律因肿瘤或地塞米松使用而紊乱，固定的“钟表时间”调度可能失效，需基于个性化生物时间而非僵化时间表。
地塞米松（DEX）作为GBM相关水肿管理的常用合成糖皮质激素，是昼夜-免疫轴的关键调控因子。DEX作为强效“授时因子”可同步肿瘤与正常组织的分子钟，可能强化BMAL1等治疗敏感节点的时间门控。但长期给药常导致深度局部与系统性免疫抑制，可能损害溶瘤昼夜病毒疗法疗效：DEX可抵消溶瘤载体诱导的TAMs耗竭，并抑制T细胞对免疫检查点抑制剂及病毒诱导抗原提呈的应答；此外，DEX通过抑制下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴，可导致患者内源性生物相位偏移，造成外部“钟表时间”与肿瘤实际脆弱窗口的不匹配。因此，个性化昼夜治疗模型必须整合个体类固醇给药方案，确保病毒递送与相对免疫警觉状态而非激素诱导的静息期重合。
“早给药更优”假说在免疫检查点抑制剂（ICIs）临床研究中获得广泛支持。MEMOIR研究（IV期黑色素瘤患者纵向分析）显示，至少20% ICI输注（伊匹木单抗、纳武利尤单抗或帕博利珠单抗）在16:30后进行，与总生存期显著缩短独立相关（中位4.8年 vs 未达到；HR 2.04）。该趋势在多种恶性肿瘤中一致：近期一项纳入713例非小细胞肺癌（NSCLC）患者的双中心双大陆研究显示，11:30为最佳截断值，11:30前接受免疫化疗的患者总生存期（33.0 vs 19.5个月）与无进展生存期均接近下午治疗组的2倍。这些结局归因于T细胞效应功能的昼夜门控及PD-1节律性表达（早晨为免疫“警觉”窗口）。对于溶瘤病毒疗法，上述数据提示，病毒诱导的“疫苗效应”（抗原释放触发）若在早晨高应答窗口发生初始病毒定植与后续免疫招募，可能产生最强效应。
放疗作为GBM治疗的另一支柱，其昼夜节律特征主要与毒性管理相关。头颈部肿瘤研究显示，早晨放疗较傍晚放疗显著降低≥3级口腔黏膜炎风险31%，因健康正常细胞在早晨处于G1期，对辐射诱导损伤的抵抗性更强。GBM特异性回顾性研究（109例患者）未发现早晨与下午放疗的生存差异，但临床前证据仍显著：大鼠胶质瘤中凋亡诱导在PER2表达峰值时最高，而正常脑组织无此现象。人类试验中缺乏明确生存获益可能因高级别胶质瘤异质性高且常呈“时间失调”（dysthymic），内源性时钟已过度紊乱，无法响应通用放疗方案。
性别特异性应答凸显个性化的重要性。EORTC 05963试验（转移性结直肠癌，5-FU+奥沙利铂）显示，相同的节律性输注方案显著延长男性生存期，但对女性较常规方案有害。这种性别二态性源于药物代谢酶的昼夜调控存在性别差异，女性常表现为更高振幅的节律，可能导致5-FU等治疗的毒性增加。鼻咽癌中也观察到类似趋势：女性化疗不良反应显著更重，尽管总体预后优于男性。现代免疫治疗中，患者性别显著影响药物清除率，提示“最佳”治疗窗口可能存在性别差异。GBM研究中虽尚未检测到BMAL1表达模式的显著性别差异，但忽略这些生物学细微差别可能因忽视女性患者的独特时间脆弱性而导致昼夜治疗方案失败。因此，“溶瘤昼夜病毒疗法”的成功路径需超越僵化钟表时间调度，纳入性别分层模型，映射至个体的特定生物相位与生理特征。
展望：通往个性化溶瘤昼夜病毒疗法的路径
将昼夜节律生物学整合至溶瘤病毒临床应用的范式转变，标志着神经肿瘤学从静态治疗模型向动态时间感知策略的演进。溶瘤病毒溶瘤效应的内在时效性由肿瘤与宿主免疫系统的昼夜景观共同决定，下一代GBM治疗需摒弃“一刀切”调度，采用溶瘤昼夜病毒疗法——将病毒给药与每日最大细胞脆弱窗口及免疫效能峰值精确对齐。
该路径面临的核心挑战是GBM显著的瘤内异质性与“时间失调”特性，但证据表明，即使处于紊乱状态，肿瘤仍常通过糖皮质激素、自主神经支配等系统信号与宿主中枢起搏器同步。这种残余同步性意味着宿主自身生物节律可作为肿瘤时间状态的易获取替代指标，允许研究人员利用个性化昼夜节律生物标志物规划病毒递送时机。
确认个体昼夜节律类型（尤其是TME的“内源时间”）是临床成功的基石。新兴技术（如多传感器可穿戴体动记录仪）可实现休息-活动周期与体温等生理参数的连续实时监测；结合TimeTeller、BodyTime等人工智能算法（可从单转录组谱建模分子钟），可为每位患者提供全面的“内源性生物钟图谱”。此外，昼夜节律核心基因（CCGs）模式的鉴定为分层患者、靶向生物学脆弱亚群提供了稳健分子框架，可将昼夜节律驱动的易感性转化为可测量的生存获益。
溶瘤病毒与TMZ、放疗等既定治疗的同步化提供独特协同机遇。回顾性分析与数学模型显示，TMZ敏感性在核心时钟蛋白BMAL1每日达峰时最高，该相位恰与DNA修复酶MGMT谷值重合。在早晨窗口（Nectin-1等病毒进入受体最丰富、DC抗原提呈功能 priming）递送溶瘤病毒，可启动“协同节律性攻击”：最大化初始感染与直接溶瘤效应，同时确保DAMPs与肿瘤相关抗原的释放发生在免疫系统最警觉的时段，促进“冷”TME向“热”免疫应答环境转化。
该原理自然延伸至GBM中已确立临床可行性的全谱系溶瘤病毒平台。近期溶瘤病毒临床试验综述明确将“最佳给药窗口”列为未解决优先级问题，本研究提出的溶瘤昼夜病毒疗法框架可直接回应这一需求。未来DNX-2401、PVSRIPO、MV-CEA及相关平台的试验应将给药时机作为预设随机化变量，结合本文所述的昼夜受体振荡数据，明确生物时机能否将临床前机制证据转化为可测量的临床获益。
未来个性化溶瘤昼夜病毒疗法的临床部署依赖于整合机制性PK-PD模型的开发，该模型需耦合病毒复制动力学与宿主24小时周期，纳入年龄、性别特异性药物代谢与免疫振幅等关键变量（这些因素已在其他癌症中证实决定昼夜疗法成败）。未来试验应转向适应性设计，基于患者个体生物相位而非外部钟表时间调度治疗，最终验证这一时间前沿的潜力。
局限性与转化挑战
尽管本综述提供了充分的生物学依据，仍需明确承认若干局限性。最核心的是，尚无前瞻性临床试验将溶瘤病毒给药时机作为正式随机化干预；本文引用的昼夜疗法疗效数据主要源自TMZ、ICIs的回顾性分析及流行病学研究，而非溶瘤病毒特异性前瞻性试验。近期Coates等的综述独立将“最佳给药窗口”列为溶瘤病毒治疗领域的未解决优先级问题，进一步凸显在未来试验设计中填补这一空白的紧迫性。其次，病毒进入受体的昼夜节律门控（Nectin-1、p75NTR）主要在小鼠感染模型与人类脑类器官中得到严谨验证，需在手术切除的人类GBM组织（理想情况下为原位多时间点瘤内活检系列）中进行直接验证。第三，高级别胶质瘤的“时间失调”特性（恶性细胞分子钟与宿主系统性节律显著去同步化）给“可穿戴设备推导的患者昼夜节律类型可可靠预测瘤内受体振荡时机”这一假设带来显著不确定性。第四，现实神经外科基础设施中早晨特异性溶瘤病毒递送的实施（受手术室可用性、麻醉 logistics、复苏容量、患者转运限制等制约）存在巨大操作挑战，临床方案需明确应对并试点测试。最后，昼夜节律类型、皮质类固醇给药、性别特异性时钟振幅及肿瘤负荷的个体间变异，将要求个性化而非群体水平的时机处方，增加试验设计复杂性。上述局限性凸显，从生物学框架到临床协议的转化需要精心设计的前瞻性适应性试验，其中给药
