《Circulation Research》：WTAP Deficiency Promotes Podocyte PANoptosis and FSGS via SPP1 Signaling
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局灶节段性肾小球硬化症（FSGS)是原发性肾小球疾病的主要病因之一，以进行性足细胞损伤和丢失为特征。本研究旨在鉴定RNA甲基化调节因子WTAP（Wilms'肿瘤1相关蛋白）作为FSGS的新型致病因素。研究人员在FSGS患者肾活检组织和阿霉素诱导的FSGS小鼠模
局灶节段性肾小球硬化症（FSGS)是原发性肾小球疾病的主要病因之一，以进行性足细胞损伤和丢失为特征。本研究旨在鉴定RNA甲基化调节因子WTAP（Wilms'肿瘤1相关蛋白）作为FSGS的新型致病因素。研究人员在FSGS患者肾活检组织和阿霉素诱导的FSGS小鼠模型的足细胞中检测WTAP表达。利用Cre-loxP系统构建两种足细胞特异性Wtap缺陷小鼠模型：组成性敲除（cKO）模型和他莫昔芬诱导性敲除模型。采用功能缺失和功能获得策略在体内外研究WTAP在足细胞中的功能作用。结果显示，FSGS患者足细胞和阿霉素诱导的FSGS小鼠模型中WTAP表达显著降低。cKO和他莫昔芬诱导性敲除小鼠均出现进行性肾小球硬化，具有FSGS的典型特征。足细胞WTAP过表达在体内外均减轻足细胞损伤。cKO小鼠多种肾细胞类型比例发生改变，包括肾固有细胞和炎症细胞。机制上，WTAP调控SPP1 m6A甲基化，从而调节其稳定性和表达。值得注意的是，SPP1介导的信号通路成为cKO小鼠肾脏病理细胞-细胞相互作用的中心枢纽，SPP1中和显著改善cKO和阿霉素诱导的FSGS小鼠的肾损伤。本研究成功构建了适用于研究FSGS致病机制和治疗靶点的2种FSGS小鼠模型，证实WTAP/SPP1（分泌磷蛋白1）信号通路参与FSGS的肾脏病理变化，靶向该通路可能是一种有前景的治疗策略。
局灶节段性肾小球硬化症（focal segmental glomerulosclerosis, FSGS)是一组以大量蛋白尿、高脂血症、低白蛋白血症和水肿为特征的临床病理综合征。足细胞（podocyte）是终末分化细胞，为肾小球滤过屏障的组成部分，在维持肾小球功能中发挥关键作用。（not only...but also）足细胞缺乏增殖或再生能力，其损伤和丢失是FSGS的标志特征，因此探究足细胞损伤和丢失的分子机制至关重要。目前已发现60余种基因与临床足细胞病变相关，包括WT1、NPHS1、NPHS2、CD2AP、TRPC6、ARHGAP24和Myole等，Yap等核蛋白和Crb2等膜蛋白亦可促进FSGS发生。此外，线粒体DNA及线粒体相关基因如ADCK4、COQ2、COQ6、PDSS2、KLF6和COX10也参与FSGS发病。鉴于致病基因的广泛性，FSGS表现出高度异质性，其完整遗传架构和潜在调控机制尚不明确，亟需鉴定新的致病基因。
WTAP（Wilms'肿瘤1相关蛋白）是WT1相互作用蛋白，广泛表达于细胞核内，分布于核质和核斑中，对多种细胞过程至关重要，并与多种疾病相关。Wtap敲除小鼠呈现组织特异性表型，包括非酒精性脂肪性肝炎、结肠炎、小脑共济失调、扩张型心肌病和心力衰竭等。WTAP纯合胚系缺失导致胚胎致死。WTAP是甲基转移酶复合物的关键组成部分，在m6A（N6-甲基腺苷，最丰富的真核mRNA内部修饰）修饰过程中发挥关键作用，同时调控可变剪接和细胞周期进程。糖尿病肾病患者WTAP表达升高，高糖条件下WTAP促进HK-2细胞中NLRP3 mRNA的m6A甲基化，增强NLRP3炎症小体激活，诱导焦亡（pyroptosis）和炎症。WTAP还通过m6A修饰促进急性肾损伤。这些发现提示WTAP参与肾脏疾病的生理和病理过程，但其在FSGS及足细胞损伤中的作用尚不清楚。
SPP1（secreted phosphoprotein 1，分泌磷蛋白1）是小整合素结合配体N-连接糖蛋白家族的成员，作为一种多效性糖蛋白，具有多种生理和病理功能，参与肿瘤、心血管疾病、慢性肾脏疾病、自身免疫病和慢性炎症等多种疾病。SPP1在肾脏中表达，可分泌至血清和尿液中，作为趋化因子介导多种细胞类型间的细胞通讯。SPP1可作为特发性膜性肾病进展的生物标志物，促进炎症和纤维化。遗传学删除SPP1可阻止脂多糖诱导和糖尿病肾损伤模型中白蛋白尿和系膜扩张等病理改变的发生，揭示SPP1对肾脏疾病进展的关键贡献。
本研究旨在探究WTAP在FSGS中的作用及其对足细胞损伤的贡献。研究人员证实FSGS患者和阿霉素诱导的FSGS小鼠足细胞中WTAP表达显著降低。为探究WTAP在足细胞损伤中的分子机制，研究利用Cre-loxP系统构建了两种足细胞特异性Wtap敲除小鼠模型：快速发病的组成性敲除（cKO）模型和他莫昔芬诱导性敲除（iKO）模型。两种基因修饰小鼠模型均成功重现了人类FSGS病理的关键特征。进一步利用单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）探究足细胞Wtap缺陷介导损伤和FSGS发病的机制，差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）分析揭示SPP1信号通路显著激活并参与FSGS发病。机制上，WTAP调控足细胞中SPP1的m6A甲基化，从而调节其稳定性和表达。
研究首先利用Kidney Interactive Transcriptomics平台分析WTAP在肾细胞群中的表达，发现其在足细胞、系膜细胞（mesangial cells, MCs）、内皮细胞和管状细胞等多种人和小鼠肾脏细胞类型中表达。Nephroseq数据库生物信息学分析显示FSGS患者肾组织中WTAP表达显著降低。FSGS患者肾活检组织免疫组织化学检测证实肾小球WTAP表达显著下调，而肾小管细胞无明显改变；肾小球WTAP表达与估算肾小球滤过率（eGFR）呈正相关，与24小时尿总蛋白呈负相关。免疫荧光染色显示FSGS患者足细胞WTAP表达较对照降低。阿霉素注射小鼠足细胞WTAP表达降低，阿霉素刺激的人足细胞（human podocyte cells, HPCs）中观察到相同下调，而阿霉素处理的HK-2肾小管上皮细胞中WTAP蛋白水平无显著变化，提示WTAP在FSGS患者足细胞和阿霉素诱导足细胞中表达下调，可能参与FSGS发病。
为探究WTAP在足细胞中的功能，研究构建足细胞特异性Wtap条件性敲除（cKO）小鼠模型。8周龄时cKO小鼠体型瘦小，肾脏体积缩小。cKO小鼠生存率显著低于对照，体重从约出生后50天开始显著下降，血糖无显著差异，但血肌酐（serum creatinine, Scr）水平显著升高。此外，cKO小鼠从21天起尿白蛋白-肌酐比值（urinary albumin-to-creatinine ratio, uACR）升高，血清可溶性尿激酶型纤溶酶原激活物受体（suPAR）水平显著高于对照。cKO小鼠4周和8周时肾脏出现显著病理改变，包括肾小球上皮细胞肿胀、增生和空泡变性，肾小管内蛋白管型明显增多；8周时PAS染色显示系膜细胞显著增生伴细胞外基质（extracellular matrix, ECM）沉积和部分肾小球硬化，这些组织病理学表现高度提示FSGS。cKO小鼠心、肝、脾、肺、胃等主要器官未见异常。
由于足细胞特异性Wtap-cKO小鼠多在2月龄内死亡，无法评估成年小鼠中Wtap缺失对肾脏表型的影响，研究进一步构建他莫昔芬诱导性足细胞特异性Wtap敲除（iKO）小鼠。8周龄时腹腔注射他莫昔芬诱导足细胞Wtap缺失。评估显示iKO小鼠体重和血糖水平均无显著改变，但uACR在他莫昔芬给药后1周和4周均显著升高；Scr水平1周后无显著变化但4周后显著升高。H&E和PAS染色显示他莫昔芬注射4周后肾脏呈现FSGS典型组织病理学特征，>50%肾小球发生硬化。
为阐明cKO小鼠肾脏内的细胞异质性，研究收集8周龄对照和cKO小鼠肾脏组织进行10× Genomics平台单细胞RNA测序，将55,811个高质量细胞分为14个主要肾脏细胞类型。WT1染色显示cKO小鼠肾脏WT1阳性细胞数量显著减少。透射电子显微镜显示cKO小鼠足细胞出现显著超微结构异常，包括足突显著减少、融合甚至消失，以及肾小球基底膜不规则。cKO小鼠足细胞中Nphs1、Nphs2和Wt1 mRNA表达下调，足细胞结构蛋白包括podocin、Nephrin和WT1水平显著降低。基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA）显示PANoptosis（泛凋亡）通路在cKO小鼠足细胞中显著富集激活，差异表达基因热图展示了PANoptosis相关基因的差异表达。建立WTAP敲除（WTAP-KO）HPCs进行YO-PRO-1/PI双染，WTAP敲除显著增加死亡细胞比例，包括YO-PRO-1阳性细胞（凋亡或坏死性凋亡指示）和PI阳性细胞（坏死性凋亡或焦亡指示）。Western blot进一步显示WTAP-KO HPCs中凋亡标志物cleaved caspase-3、焦亡标志物cleaved caspase-1、坏死性凋亡标志物p-MLKL和p-RIPK1水平升高，Bax升高而Bcl2降低，为PANoptosis提供了进一步验证。
为研究WTAP过表达能否缓解阿霉素介导的足细胞损伤，研究人员构建了稳定过表达WTAP的足细胞系（OE-WTAP HPCs）。OE-WTAP HPCs中WTAP过表达显著缓解阿霉素刺激16小时后的足细胞损伤，表现为WT1、Nephrin和NPHS2表达增加。体内实验中，通过尾静脉注射携带足细胞特异性WTAP启动子的腺相关病毒血清型9（adeno-associated virus serotype 9, AAV9）在BALB/c小鼠中实现足细胞WTAP过表达，免疫荧光确认成功建立稳定过表达WTAP的小鼠足细胞。阿霉素注射2周后，过表达WTAP小鼠uACR和Scr水平显著降低，PAS染色显示肾小球硬化显著减轻。
机制研究方面，研究人员分析单细胞测序数据中14种细胞类型的差异上调基因，鉴定出20个共上调基因，包括Spp1。分析9种肾固有细胞类型中SPP1高表达细胞比例变化，发现肾小球细胞（包括足细胞、内皮细胞和系膜细胞）中SPP1高表达细胞比例显著高于肾小管细胞，提示升高的SPP1水平主要来源于肾小球细胞。建立的WTAP敲除HPC细胞系验证显示，WTAP缺失显著增加SPP1的mRNA和蛋白表达。点印迹分析显示WTAP敲除显著降低细胞RNA m6A甲基化水平。利用RM2Target数据库预测SPP1为WTAP的下游靶点，甲基化RNA免疫沉淀测序（meRIP-seq）结果显示WTAP-KO HPCs中SPP1基因m6A甲基化峰改变。通过m6A RNA甲基化预测网站预测SPP1基因4个高置信度甲基化位点，据此设计3对引物进行meRIP-qPCR验证，结果显示WTAP敲低后SPP1 m6A甲基化水平均显著下调。放线菌素D（ActD）抑制基因转录实验显示WTAP敲除后SPP1基因稳定性增加。
肾小球是肾脏的滤过单位，由内皮细胞、足细胞和系膜细胞三种主要特化细胞组成。与对照相比，cKO小鼠足细胞和肾小球内皮细胞比例降低，而系膜细胞比例显著升高。cKO小鼠足细胞、系膜细胞和内皮细胞间通讯显著增强。系膜细胞通过分泌ECM维持肾小球毛细血管袢稳定性，但过度ECM沉积促进肾小球硬化。KEGG分析显示cKO小鼠系膜细胞差异基因富集于ECM-受体相互作用、紧密连接和黏着斑通路；肾小球内皮细胞差异基因与细胞衰老、自噬和黏着斑通路相关。配体-受体配对分析显示系膜细胞可能通过SPP1-ITGAV/ITGB1轴与内皮细胞和足细胞通讯，该轴也参与系膜细胞自身相互作用，可能促进系膜细胞增生。细胞-细胞通讯分析显示cKO小鼠肾小球细胞中SPP1信号通路差异富集，层级图进一步展示SPP1信号通路的细胞间通讯网络。
cKO小鼠近端小管（proximal tubule, PT）细胞比例显著降低。亚型分析显示7个不同PT亚型簇：PTS1、PTS2、PTS3、PTB、表达Ly86的PT（PTLy86+）、表达CP的PT（PTCP+）和增殖性PT，其中PTS1和PTS3细胞比例下降最显著，代谢信号通路改变最明显。尽管PT细胞比例降低，但PTS2、PTCP、增殖性PT和PTLy86+细胞百分比显著增加。其他管状细胞分析显示厚升支和远曲小管比例降低，集合管闰细胞比例增加。cKO小鼠PT、厚升支、远曲小管和集合管间通讯分析发现，SPP1-ITGAV/ITGB1信号靶向集合管闰细胞的通讯显著增加，来源于其他4种管状类型。SPP1信号在两组间表现出显著差异，层级图展示了SPP1信号通路的细胞间通讯网络。免疫组织化学分析显示cKO小鼠SPP1表达上调，ELISA结果显示cKO小鼠血清和尿液SPP1水平显著上调。iKO小鼠中观察到一致结果。
为探究升高的SPP1在cKO小鼠中的功能作用，研究采用中和抗体抑制SPP1。5周龄cKO小鼠每2天腹腔注射SPP1中和抗体（100 μg/kg）持续2周。治疗后抗SPP1组血清SPP1水平显著低于IgG对照组。SPP1抗体治疗有效减缓了cKO小鼠的进行性体重下降，uACR和Scr水平显著降低，PAS染色显示中和循环SPP1抑制了系膜细胞增生、ECM沉积和肾小球硬化。
为确定SPP1中和抗体对阿霉素诱导FSGS模型的保护作用，研究人员通过尾静脉注射15 mg/kg阿霉素，随后每2天连续注射IgG（对照）和SPP1中和抗体共7次。治疗2周后，抗SPP1处理小鼠血清SPP1水平显著低于IgG对照。SPP1抗体治疗不影响体重，但uACR和Scr水平显著降低，同时抑制系膜细胞增生、ECM沉积和肾小球硬化。体外实验中，不同剂量SPP1中和抗体处理WTAP-KO HPCs 48小时后，足细胞损伤标志物和PANoptotic蛋白表达显示SPP1中和抗体缓解足细胞损伤和PANoptosis。
讨论部分，研究人员指出FSGS是一种危及生命的肾病形式，足细胞损伤驱动疾病进展。本研究鉴定了WTAP调控足细胞损伤和FSGS的新作用：足细胞WTAP过表达减轻FSGS，而WTAP敲除加重FSGS；SPP1作为足细胞损伤的关键调节因子，被鉴定为WTAP在足细胞中的直接靶点和新的底物。WTAP缺陷损害SPP1降解，导致足细胞PANoptosis和随后的FSGS；相反，WTAP过表达产生相反效应。这些结果提示WTAP/SPP1介导的足细胞PANoptosis与FSGS之间存在重要联系，WTAP可能代表干预和治疗FSGS的有前景的治疗靶点。
研究人员特别讨论了模型构建的意义：虽然阿霉素诱导的FSGS小鼠模型广泛应用，但存在显著全身毒性。本研究建立的cKO和iKO两种模型实现了足细胞中Wtap的选择性缺失而不影响其他细胞类型，能够精确研究其在足细胞中的特异性作用。cKO小鼠4周龄出现严重白蛋白尿，8周龄发展为严重FSGS，适合研究早发型FSGS。iKO小鼠他莫昔芬诱导4周后出现典型FSGS病变，解决了足细胞特异性Wtap敲除小鼠过早致死的问题，规避了对肾脏发育的潜在混杂影响，适合研究成人型FSGS。这些发现表明WTAP在足细胞分化阶段和成熟足细胞存活中均发挥关键作用。
关于PANoptosis，研究人员指出这是最近鉴定的一种程序性细胞死亡形式，具有焦亡、凋亡和坏死性凋亡的特征，但不能单独用这三种通路中的任何一种解释。足细胞可发生PANoptosis，cKO小鼠足细胞中上调的差异基因参与PANoptosis相关的多条细胞信号通路，各种升高的PANoptosis标志物证实了Wtap缺陷诱导的足细胞PANoptosis。足细胞PANoptosis可能与足细胞脱落、功能障碍和从肾小球基底膜脱落，随后黏附于Bowman囊并被壁层细胞覆盖，最终导致节段性硬化有关。据研究人员所知，这在FSGS中是一项尚未被描述过的新发现。
本研究局限性包括：WTAP在FSGS患者和阿霉素诱导足细胞中下调的分子机制尚待阐明；不能排除除SPP1/PANoptosis通路外其他分子/通路参与WTAP调控肾损伤和FSGS的潜在作用；作为m6A甲基化写入器，WTAP敲除可能扰乱SPP1以外的其他底物，导致FSGS背景下的脱靶效应；单细胞RNA测序分析虽对解密个体细胞独特的基因表达谱至关重要，但可能导致部分空间背景丢失，需要整合单细胞测序、空间转录组学、蛋白质组学和代谢组学等多组学方法的进一步研究。
研究结论部分指出，本研究揭示了足细胞WTAP缺陷作为有害因素，通过介导SPP1 m6A甲基化促进其mRNA稳定性，进而激活PANoptotic信号通路和促进FSGS发展，导致足细胞损伤和FSGS。重要的是，本研究成功构建了适用于研究FSGS或其他肾脏疾病病理机制的2种FSGS小鼠模型，也为开发或评估旨在预防或治疗肾脏疾病的治疗方案提供了关键工具。此外，WTAP过表达或SPP1药理抑制显著减轻足细胞损伤和改善FSGS。这些见解可能为靶向足细胞损伤相关肾脏疾病的创新治疗铺平道路。
