立体选择性血浆分析中天然氨基酸探针与氟化氨基酸探针的对比评估：一项基于手性LC–MS/MS的概念验证研究

《Journal of Chromatography B》：Comparative evaluation of native and fluorinated amino acid probes in stereoselective plasma profiling: A proof-of-concept study by chiral LC–MS/MS

　　

康尼亚裕隆|福田浩辅|梅谷直久|藤原翔|落合良辅|藤原智|奥村武|辻野和重|宫胁泉

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  通过手性LC–MS/MS技术实现了三种氨基酸探针的立体选择性定量分析。
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  DL-Ala-d?和DL-Ser-d?在早期阶段就表现出明显的对映体失衡现象。
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  DL-Ala-F?的初始D型和L型对映体浓度几乎相同。
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  探针的结构显著影响了其血浆中的立体选择性浓度变化曲线。
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  选择合适的探针对于准确解读立体选择性血浆浓度数据非常重要。

引言

除甘氨酸外，所有构成蛋白质的氨基酸都具有手性中心，存在L型和D型两种对映体。尽管它们的物理化学性质极为相似，但长期以来，要准确区分较为丰富的L型D型氨基酸一直颇具挑战性，这也限制了相关研究的发展[1]、[2]、[3]。不过，随着手性分析技术的进步，现在已能实现可靠的针对特定对映体的定量分析，研究表明D型氨基酸并非仅仅是微量成分，它们在生物系统中发挥着多种作用，比如参与神经传递以及与疾病相关的过程[4]、[5]、[6]、[7]、[8]、[9]。

在哺乳动物体内，D型氨基酸来源于体内的生物合成、饮食以及肠道微生物群，可在血浆和尿液等生物液中检测到[10]、[11]、[12]、[13]、[14]。L型氨基酸能在肾近端小管中被高效重吸收，而D型氨基酸的重吸收程度较低，更容易被排出体外[15]、[16]、[17]。这种具有立体选择性的肾脏重吸收特性推动了针对特定对映体分析方法的临床应用。例如，血浆中的D/l-丝氨酸比例已被视为判断肾功能异常的敏感指标[16]、[18]。但从分析和机制层面来看，立体选择性血浆分析结果的可靠性取决于所观察到的对映体差异主要是由器官特异性的转运机制导致的，还是由探针本身的代谢或分布特性所引起的。氨基酸的对映体的生物合成、降解、酶促转化以及饮食因素都可能影响其在血浆中的浓度，这些因素可能会掩盖肾脏的作用，增加对立体选择性血浆分析结果解读的难度。

为克服这些局限性，人们开始使用同位素标记的氨基酸来区分外源性摄入的化合物与体内原有的氨基酸[19]、[20]、[21]。然而，氘标记的氨基酸仍可能发生代谢转化，进而导致对映体比例出现变化，增加结果解读的复杂性。因此，探针本身的代谢或分布特性很可能对立体选择性血浆浓度曲线产生重要影响，但目前尚未对此进行系统性的研究。由于立体选择性血浆分析旨在反映与转运相关的物质分布情况，而非探针的代谢过程，使用代谢稳定性较高的示踪剂或许有助于更直接地解读针对特定对映体的血浆浓度数据。

氟代氨基酸类似物被视为很有前景的替代选择，因为氟化处理通常能降低氨基酸被酶催化转化的概率。尤其是三氟甲基取代的丙氨酸（AlaF₃），由于其CF₃基团具有很强的吸电子效应，相比天然氨基酸更不易发生代谢修饰，同时仍能与天然氨基酸保持结构相似性[22]。这类代谢稳定性高的示踪剂或许有助于更直接地解读立体选择性血浆浓度曲线。

传统的带有荧光检测功能的二维高效液相色谱法需要经过衍生化处理，且无法区分同位素标记的化合物与体内原有的同类物质[16]、[18]、[23]、[24]、[25]。相比之下，手性液相色谱-串联质谱法则无需衍生化处理，就能以高选择性实现针对特定对映体的直接定量分析，还能同时准确区分不同的同位素标记[13]、[14]、[26]、[27]、[28]。

这项概念验证研究的目的是探讨探针的分子结构如何影响立体选择性血浆分析的结果。为了进行验证，研究人员选择了两种氘标记的天然氨基酸（DL-Ala-d₃和DL-Ser-d₃），预计它们的血浆浓度变化曲线会与体内天然氨基酸的相似；另外还选择了一种非天然氨基酸（DL-Ala-F₃）。将这三种探针一同给予大鼠，以便比较它们在血浆中的浓度变化情况。在测量血浆浓度之前，首先评估了该手性LC–MS/MS分析方法在针对这三种探针时在对映体分离度以及信号强度方面的表现。

章节要点

材料

DL-Ala-d₃和DL-Ser-d₃购自加拿大安大略省的CDN Isotopes Inc.公司；DL-Ala-F₃则购自英国曼彻斯特的Apollo Scientific Ltd.公司。未标记的DL-Ala-d₀和DL-Ser-d₀来自日本东京的Kanto Chemical Co., Inc.公司。肌酐（Wako特殊级）由日本大阪的FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation公司提供。β-氯-DL-丙氨酸水合物（DL-Ala-Cl）则购自美国德克萨斯州达拉斯的Santa Cruz Biotechnology Inc.公司。三氟乙酸（TFA；Wako特殊级）……

手性LC–MS/MS分析方法的优化

通过采用基于冠醚的手性固定相的LC–MS/MS技术，实现了对DL-Ala-d?、DL-Ser-d?以及DL-Ala-F?的针对特定对映体的定量分析，而且无需进行衍生化处理即可直接进行分析。由于要想实现立体选择性分析，足够的色谱分离效果以及较强的峰强度是非常重要的，因此在分析从动物实验中采集的血浆样本之前，首先对这些参数进行了评估。

结论

针对氨基酸对映体的立体选择性血浆分析被认为是一种用于研究器官特异性转运过程的有效方法。不过，探针本身的代谢或分布特性可能会影响对立体选择性血浆浓度数据的解读。在这项概念验证研究中，研究人员将三种探针（DL-Ala-F₃、DL-Ala-d₃以及DL-Ser-d₃）以混合形式静脉注射给大鼠，每种探针的剂量为20毫克/千克，实验组共有3只大鼠。通过对这些探针进行针对特定对映体的分析……

CRediT作者贡献说明

康尼亚裕隆：文章撰写——审阅与编辑、文章撰写——初稿撰写、可视化分析、实验研究、正式数据分析、数据整理、研究构思。 福田浩辅：文章撰写——审阅与编辑、文章撰写——初稿撰写、实验研究、数据整理、研究构思。 梅谷直久：文章撰写——审阅与编辑、方法设计、实验研究。 藤原翔：文章撰写——审阅与编辑、实验研究。 落合良辅：文章撰写——审阅与编辑、方法设计、实验研究。 藤原智：文章撰写——

未引用参考文献

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利益冲突声明

所有作者均声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。

致谢

我们要感谢Editage公司（www.editage.jp）为本文提供的英文润色服务。

伦理审批情况

住友制药有限公司研发部门的机构动物护理与使用委员会已经批准了这项研究方案（批准编号：24RA0028-001）。

资金支持情况

这项研究没有获得任何来自公共部门、商业机构或非营利组织的专项资助。