基于蛋白质组学技术评估淡足鹱（*Ardenna carneipes*）不同生活史阶段的生理变异

《Ibis》：Life-stage variation in Sable Shearwater (Ardenna carneipes) physiology assessed using proteomics

　　

海鸟生活史阶段的转变涉及生理需求的显著变化，但其分子机制尚不明确。研究人员采用非靶向数据非依赖性采集质谱（DIA-MS）技术，表征并比较了即将离巢的幼鸟与迁徙返回后繁殖季初期的成年淡足鹱（*Ardenna carneipes*）的血浆蛋白质组。蛋白质组分析共鉴定出726个血浆蛋白，其中306个（42%）在生活史阶段间存在显著差异。幼鸟表现出与细胞外基质（ECM）组织和糖酵解代谢相关蛋白质组途径的富集，这与快速生长、组织发育以及离巢前的代谢准备相一致；而成鸟则显示出补体和凝血途径以及ECM重塑的富集，反映了与组织和代谢维持相关的生理状态。这些发现共同证明，血浆蛋白质组学能够解析野生海鸟跨生活史阶段的协调性系统级生理差异。该研究为理解发育期与成体生理学提供了分子框架，并凸显了蛋白质组学在检测与生态学和保育相关的细微生理变化方面的潜力。

海鸟不同生活史阶段的生理需求差异显著，反映了生长、发育和维持优先级的转变。早期生活阶段代表一种独特的生理状态，以生长和生理成熟为特征。在此期间，个体完成结构生长、发育飞行肌肉，并建立维持飞行、觅食以及某些物种迁徙所需的代谢和免疫功能。亲鸟哺育期间若未能积累足够的能量储备，可导致离巢后幼鸟高死亡率。相比之下，成年海鸟已完成结构发育，其生理状态以稳态调节、维持和修复相关过程为特征。理解这些对比鲜明的生理需求如何在分子水平体现，是鸟类生理学的基础问题，但在野生海鸟中仍远未解决。

传统上海鸟生理学评估依赖形态测量和身体状况指标，这些指标有助于建立基线并检测晚期衰退，通常反映累积结果，但不足以捕捉或解析潜在机制或生理应激的早期信号。为获得更具机制性的认识，研究人员已将靶向生化和激素测定应用于海鸟粪便、羽毛和血液样本，但解读常受限制。常见生理应激指标如循环皮质酮（CORT）可因捕捉和处理而迅速升高，使基线值的解读复杂化。更具敏感性的靶向生化方法通过检测循环代谢物来推断生理状态，但这些基于先验假设的方法可能限制对未预期或协调性生理变化的检测。

系统级分子方法通过捕捉整合性生理反应而无需预先选择靶点，为克服这些局限提供了途径。蛋白质组学通过量化介导生物学功能的高丰度蛋白来表征生理过程和状态，反映代谢、结构、免疫和调节途径的变化。质谱技术的进步，包括数据非依赖性采集（DIA-MS），现可实现小样本体积的高通量非靶向蛋白质组分析。尽管野生物种的分子研究常因缺乏物种特异性参考数据库而受限，但许多高丰度蛋白在分类群间保守，使得利用近缘物种参考数据库进行有意义的解读成为可能。

淡足鹱是研究野生海鸟生活史特异性生理过程的理想模型。这种长寿命远洋海鸟为跨赤道迁徙种，主要在澳大利亚和新西兰繁殖，每年约8个月在南方繁殖地度过，然后迁徙至北半球越冬。成鸟于9月下旬开始到达繁殖地进行求偶，配对亲鸟共同负责巢穴维护、孵卵和育雏。卵于12月初产下，孵化约60天。孵化后，雏鸟通过亲鸟反刍喂养，在巢洞中停留80-90天，于5月初离巢。在此期间，雏鸟积累脂肪储备，离巢前体重可能超过成鸟；亲鸟在离巢前数周停止喂养，雏鸟依靠这些储备直至离巢。淡足鹱一直是长期监测项目的焦点，主要因其高塑料摄入率及相关保育关注，积累了广泛的生态、种群和健康相关数据集，为非靶向假设检验的整合提供了坚实基础。

本研究旨在利用非靶向DIA-MS蛋白质组学表征并比较淡足鹱幼鸟和成鸟的血浆蛋白质组，通过检测蛋白丰度差异，识别发育生理学相关的生物学途径和过程。

研究样本来自豪勋爵岛（Lord Howe Island；31.554°S, 159.065°E）。幼鸟样本（80-90日龄；n=19）于2024年4月26日至5月11日傍晚离巢前期采集；成鸟样本（n=24）为已知年龄的回捕个体（5-13岁），于2024年10月2-12日迁徙返回后繁殖季初期采集，代表迁后/繁殖前生理状态。鉴于塑料摄入已知可显著改变幼鸟蛋白质组，研究选择塑料暴露量低的个体（灌胃回收<0.1 g）以最小化混杂效应。每只鸟从肱静脉采集约1 ml全血，经抗凝处理后离心分离血浆，-80°C保存至2024年11月进行实验室处理。

蛋白质组学制备采用优化流程：血浆样本经蛋白提取试剂稀释后，通过Pierce 660 nm法定量；30 μg蛋白样本经二硫苏糖醇（DTT)还原、碘乙酰胺烷基化后，以胰蛋白酶/LysC按1:25酶蛋白比消化（SP3法），C18 ZipTips脱盐。肽段样本经Ultimate nanoHPLC系统分离，Q-Exactive HF质谱仪进行DIA-MS分析：120 min梯度，300 nl/min流速，250 mm×75 μm C18捕获柱，45°C；MS1分辨率120,000，AGC 3e6；MS2采用26个DIA窗口（397.5-1027.5 m/z，25 amu/窗口，1 amu重叠）。

数据分析使用Spectronaut软件（v19）对抗北贼鸥（*Fulmarus glacialis*）蛋白质序列数据库搜索，生成了包含2170个蛋白质组学肽段和966个蛋白组的项目特异性谱库。经交叉运行标准化后，导入R进行统计和生物信息学分析。差异分析限定于两组中>70%样本均可检测到的蛋白，采用广义线性模型评估丰度差异，残差经Q-Q图和残差-拟合图评估正态性和同方差性，必要时Box-Cox转换；P值经错误发现率（FDR）校正，P<0.05为显著。通过缩放主成分分析（PCA）和火山图可视化全局差异。功能富集分析以所有检测蛋白为背景集，对显著差异蛋白（P<0.05且倍数变化>1.5）进行基因本体（GO)、京都基因与基因组百科全书（KEGG）和WikiPathways数据库富集分析，并行10,000次置换检验。此外，针对糖酵解/糖异生（hsa00010)通路进行反向富集分析，以评估传统富集分析因检测不足而效力受限时的代谢途径系统性差异。

蛋白质组分析揭示了淡足鹱幼鸟与成鸟之间清晰的生活史阶段特异性差异。在726个可检测和可鉴定的血浆蛋白中，306个在生活史阶段间存在显著差异（FDR校正P<0.05），占可测量蛋白质组的42%。缩放PCA显示幼鸟与成鸟之间清晰分离，表明血浆蛋白质组构成存在广泛差异；成鸟内部PCA显示近期回归/新繁殖个体（5-6岁）与已建立繁殖个体之间无明显分离，提示采样年龄范围内（5-13岁，>7岁）成鸟蛋白质组特征 broadly相似。

幼鸟的蛋白质组特征体现在：（1）血液凝固方面，多种补体和凝血蛋白丰度低于成鸟，凝血相关途径整体 depleted，仅von Willebrand因子（VWF)升高；这反映发育阶段肝脏功能的差异，因多数凝血蛋白在肝脏合成。（2）细胞外基质组织与结构发育方面，胶原含ECM（GO:0062023)为幼鸟一致富集的过程，包括胶原蛋白I型α1链（COL1A1）、VI型α2链（COL6A2）和α3链（COL6A3）等结构胶原，与生长和发育相关的活跃ECM组织一致；此外骨膜蛋白（POSTN)、胶原蛋白II型α1链（COL2A1)、光蛋白聚糖（LUM)、巢蛋白1（NID1)和软骨寡聚基质蛋白（COMP）等ECM相关小结富集，参与软骨、骨和结缔组织形成，指示该生活史阶段的持续结构组织。（3）代谢途径方面，幼鸟富集糖酵解酶类，包括丙糖磷酸异构酶1（TPI1）、磷酸葡萄糖变位酶1（PGM1）和烯醇化酶1（ENO1），表明代谢特征趋向快速能量产生和生物合成；载脂蛋白D（APOD）和脂肪酸结合蛋白4（FABP4）的富集指示活跃的脂质转运和储存，并与产热相关途径重叠，反映幼鸟离巢后维持体温和动员脂肪储备的双重挑战。

成鸟的蛋白质组特征体现在：（1）血液凝固方面，补体和凝血蛋白相对幼鸟富集，除VWF外所有凝血因子均富集，这与维持组织完整性和响应损伤或感染的完全发育功能性止血系统一致。（2）ECM组织与稳态维持方面，富集胶原蛋白XII型α1链（COL12A1)、间α胰蛋白酶抑制剂重链2（ITIH2)、纤溶酶原（PLG)、转化生长因子β诱导蛋白（TGFBI）和乙酰胆碱酯酶（ACHE），这些蛋白与ECM稳定、重塑和组织维持相关。（3）代谢途径方面，糖异生和脂质代谢相关途径富集，多磷酸肌醇磷酸酶1（MINPP1)、丙酮酸激酶（PKM）、醛缩酶B（ALDOB）和苹果酸酶1（ME1）参与这些富集，映射到葡萄糖生产和脂质相关代谢过程。

讨论部分指出，血浆蛋白质组学揭示了淡足鹱幼鸟与成鸟之间清晰的生活史差异，反映晚期发育与成体维持的对比生理需求。途径富集分析表明，差异主要围绕三个关键生理过程：肝功能、ECM组织和组织重塑、以及代谢调节。这些模式共同表明，幼鸟正在进行循环、结构和代谢系统的协调性成熟以备独立生活，而成鸟则显示与维持、修复和能量调整一致的标志，处于年周期中的动态阶段。

研究人员强调，两个生活史阶段均在生理变化期采样，这限制了定义真正基线状态的能力。这在迁徙海鸟中尤为挑战，因其年周期中不存在某种季节性过程需求不明显的真正对照阶段。因此，这些蛋白质组差异需在各自生活史阶段背景下解读，而非偏离固定生理基线。

关于跨生活史阶段的肝功能，幼鸟凝血因子降低与许多动物未成熟发育阶段一致，可能反映发育中肝脏合成能力的差异。所有凝血因子在成鸟中相对富集，仅VWF在幼鸟中更高；VWF由内皮细胞而非肝脏产生，在肝脏发育期间维持稳态中起关键作用，这进一步强调了早期生活阶段的凝血独特性。幼鸟气体运输相关蛋白的富集支持关键生理过程和系统的活跃发育：幼鸟加速红细胞（RBC）生成以满足发育组织的高氧需求，增加循环细胞外血红蛋白和其他RBC衍生蛋白；早期RBC因结构和代谢不成熟而寿命较短，导致细胞更新增加；加之肝脏清除途径尚不成熟，血红蛋白衍生分解产物的清除效率较低，提高了RBC衍生蛋白在血浆中的可检测性。成鸟凝血因子的富集与血管修复和伤口愈合过程重合，但缺乏非迁徙成鸟基线，难以确定这是否代表成鸟正常水平或繁殖期额外的维持需求。

关于ECM动力学，ECM相关富集在幼鸟中强于成鸟，反映发育期间快速生长和组织组织。幼鸟中POSTN、COL2A1、LUM和NID1的富集参与软骨、骨和结缔组织发育；COMP在承重活动开始前上调，功能为组织和强化软骨及肌腱，其富集表明ECM过程正积极准备飞行的机械需求。相比之下，成鸟ECM富集整体较弱，但COL12A1在成鸟中富集，该蛋白响应机械应激而增加，可能反映持续机械负荷下成体组织的结构强化和适应。成鸟中富集的ECM相关途径还涉及通过炎症促进伤口愈合的蛋白，功能为组织重塑和结构稳定，以及ACHE的富集，该蛋白在中等至慢性运动后富集，作为神经肌肉适应的一部分，增强乙酰胆碱分解以促进更有效的肌肉松弛和减少运动后疲劳。这些与炎症、修复和稳定相关的ECM标志反映剧烈运动后（如重复觅食或迁徙）的恢复阶段，但同样缺乏成鸟生理基线，难以确定其为正常状态或运动后修复指标。

关于代谢，发育期间雏鸟积累显著脂肪储备以支持喂养间隔期间的持续生长，这些储备随后用于发育、羽毛生长和肌肉肥大，将脂肪储备降至更适合飞行的水平。许多鹱形目种类中亲鸟在离巢前停止喂养是普遍现象，支持这一减重过程。幼鸟中脂肪转运和结合蛋白的存在支持发育期间的资源充裕状态。观察到的产热途径富集与海鸟更广泛的发育性热调节策略转变一致，离巢幼鸟从绒羽向成熟羽毛转变的同时，投资肌肉发育和调节性解偶联蛋白，启用颤抖产热和更大程度上依赖脂质供热的产生。成鸟中糖异生途径的富集表明代谢转向从非碳水化合物来源合成葡萄糖，这对禁食或低热量摄入期间维持代谢功能至关重要；ME1的增加突出增强的脂质代谢，其催化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）的产生，常与能量需求期后耗竭脂肪储备的 replenishment 相关，但也在代谢应激条件下维持电子传递链和ATP输出中发挥更广泛作用。鸟类实验工作证实ME1对能量状态动态调节，禁食早期上调，储备耗竭后下降，再喂养随脂肪生成恢复而显著增加。此模式与Scopoli's Shearwaters之前的研究一致，迁徙后能量代谢的转变反映了从迁徙到非迁徙生理状态的转变。

该研究的生物学意义在于，血浆蛋白质组学揭示了淡足鹱清晰的生活史分化：幼鸟以生长、结构成熟和发育性止血为特征，成鸟则以与组织维持和繁殖季早期代谢调节一致的途径为特征。这些结果证明了蛋白质组学解析协调性生理过程的价值。未来研究应将蛋白质组状态与同步表型（如身体状况、觅食指标和繁殖结果）相关联，以建立蛋白质组学是否能稳健洞察"高需求"与"低需求"成鸟状态。

研究结论指出，血浆蛋白质组学揭示了淡足鹱清晰的生活史差异化：幼鸟以生长、结构成熟和发育性止血为特征，成鸟则以与早期繁殖季节组织维持和代谢调节一致的途径为特征。这些结果证明了蛋白质组学解析协调性生理过程的价值，并为理解鸟类发育与成体生理学建立了分子 profile，可据此识别和解读偏离情况。该研究发表于《Ibis》，为海鸟生理状态的分子基础提供了重要见解，并凸显了蛋白质组学作为检测与生态学和保育相关细微生理变化工具的潜力。