《Journal of Neuroendocrinology》：Mapping of oxytocin- and arginine vasopressin-expressing neurons with calbindin 1 or reelin in the male mouse brain
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研究人员将Fluorogold（FG）通过尾静脉注射给成年雄性C57BL/6J小鼠。通过免疫细胞化学检测终纹床核（BNST）、室旁核（PVN）、视上核（SON）和视交叉后视上核（SOR）中OXT和AVP合成神经元中钙结合蛋白1（calbindin 1）和ree
研究人员将Fluorogold（FG）通过尾静脉注射给成年雄性C57BL/6J小鼠。通过免疫细胞化学检测终纹床核（BNST）、室旁核（PVN）、视上核（SON）和视交叉后视上核（SOR）中OXT和AVP合成神经元中钙结合蛋白1（calbindin 1）和reelin的表达。FG标记的神经元分布于PVN、SON和SOR。前部PVN、SON和SOR中的大多数OXT免疫反应性（ir）神经元是FG阳性的，而后部PVN中的许多OXT-ir神经元是FG阴性的。大多数FG阳性的OXT-ir神经元显示钙结合蛋白1免疫反应性。后部PVN中三分之二的FG阴性OXT-ir神经元表达reelin。几乎所有Reln阳性的OXT-ir神经元都是FG阴性的。几乎所有AVP-ir神经元都是FG阳性的，超过一半表达钙结合蛋白1，而未检测到reelin表达。在促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）-Venus敲入小鼠中，AVP-ir神经元和CRH阳性神经元在PVN内不共定位，且AVP-ir和CRH阳性纤维定位于正中隆起的不同层。这些发现表明，小细胞CRH神经元中的AVP表达低于本研究方法检测阈值。钙结合蛋白1可作为大细胞OXT神经元的标记物，而reelin识别小细胞OXT神经元的一个亚群。鉴于检测到的AVP-ir神经元主要是大细胞型，钙结合蛋白1标记了该大细胞AVP群体中的一个亚群。这种分子差异为区分OXT和AVP表达神经元群体以及研究它们在内分泌和行为调节中的各自作用提供了框架。
**论文解读：钙结合蛋白1与reelin区分小鼠脑内催产素和精氨酸加压素神经元亚群的分子图谱研究**
**1. 研究背景与问题**
催产素（oxytocin，OXT）和精氨酸加压素（arginine vasopressin，AVP）是调节生殖、社交行为、应激反应、能量代谢及渗透压平衡的关键神经肽。传统上，合成OXT和AVP的神经元根据其投射靶点被分为两大类：大细胞（magnocellular）神经元，主要投射至垂体后叶释放激素进入体循环；小细胞（parvocellular）神经元，投射至前脑、脑干和脊髓或通过正中隆起到达垂体门脉系统。然而，目前缺乏能在下丘脑不同核团中可靠区分这两种亚型的分子标志物。虽然单细胞转录组学研究提示，钙结合蛋白1（calbindin 1，由Calb1基因编码）和reelin（由Reln基因编码）在下丘脑室旁核（PVN）的OXT神经元中差异表达，但这种分子区分是否适用于PVN以外的OXT神经元或AVP神经元仍不清楚。此外，传统的Fluorogold（FG）逆行示踪法在区分大细胞与小细胞AVP神经元方面存在局限，因其可通过血脑屏障外的神经末梢同时标记两类细胞，且静脉注射FG技术要求高且存在潜在神经毒性。因此，寻找可靠的分子标志物成为替代传统示踪技术的重要方向。本研究旨在系统验证calbindin 1和reelin能否作为分子标志物，用以区分终纹床核（BNST）、PVN、视上核（SON）和视交叉后视上核（SOR）中的大细胞与小细胞OXT及AVP神经元。该论文发表在《Journal of Neuroendocrinology》。
**2. 主要关键技术方法**
研究人员使用了成年雄性C57BL/6J小鼠（来源于The Jackson Laboratory Japan）和CRH-Venus敲入杂合小鼠。通过尾静脉注射4% Fluorogold（FG，Santa Cruz Biotechnology）进行逆行示踪，1周后取材。采用免疫细胞化学（immunocytochemistry）结合共聚焦显微镜成像，在BNST、PVN、SON和SOR四个脑区分别检测OXT-免疫反应性（ir）或AVP-ir神经元与calbindin 1-ir、reelin-ir及FG信号的共定位。在CRH-Venus小鼠中，使用抗GFP抗体标记促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）阳性神经元，分析AVP-ir与CRH的共定位及纤维在正中隆起（ME）的分布。图像定量分析使用ImageJ软件（版本1.54k），计数各脑区不同标记的神经元数量和百分率。
**3. 研究结果**
**3.1 Fluorogold标记细胞的分布**
通过尾静脉注射FG后1周，研究人员在BNST、PVN、SON和SOR观察FG信号。BNST中FG标记稀疏；PVN中FG标记在前部密集，后部显著减少；SON和SOR沿rostrocaudal轴均分布有FG阳性细胞，中央区域稍多。这一分布模式与已知的大细胞神经元投射到垂体后叶的解剖特征一致，确认了FG作为大细胞神经元逆行示踪剂的有效性。
**3.2 OXT-ir神经元中calbindin 1和reelin的表达**
在BNST、前部PVN、SON和SOR中，超过80%的OXT-ir神经元为FG阳性（分别为81.2%、94.6%、95.2%和91.4%），提示这些区域的大多数OXT神经元为大细胞型。后部PVN中仅41.6%的OXT-ir神经元为FG阳性。钙结合蛋白1在总OXT-ir神经元中的表达比例在BNST为57%，前部PVN为80%，SON为92%，SOR为71%，但在后部PVN仅为32%。在FG阳性的OXT-ir神经元中，calbindin 1表达率在各脑区为66.0%–92.7%；反之，calbindin 1阳性的OXT-ir神经元中绝大多数（88.5%–96.6%）也为FG阳性。这表明calbindin 1可作为BNST、前部PVN、SON和SOR中大细胞OXT神经元的免疫细胞化学标志物。
Reelin在BNST、前部PVN、SON和SOR的OXT-ir神经元中表达极少（<2%），但在后部PVN中高达46%。仅极小比例FG阳性OXT-ir神经元表达reelin（<10%），而大多数FG阴性的OXT-ir神经元（64.2%）以及大多数reelin阳性OXT-ir神经元（93.2%）均不携带FG。说明reelin主要标记后部PVN中的一个小细胞OXT神经元亚群，而非全部小细胞OXT群体，揭示小细胞OXT神经元内部的分子异质性。
**3.3 AVP神经元中calbindin 1和reelin的表达**
在BNST中未观察到AVP-ir细胞。在PVN、SON和SOR中，57%–68%的AVP-ir神经元共表达calbindin 1。几乎所有AVP-ir神经元（>97%）均为FG阳性，且超过一半的FG阳性AVP-ir神经元表达calbindin 1。反之，几乎全部calbindin 1阳性的AVP-ir神经元也为FG阳性。Reelin在AVP-ir神经元中几乎不表达（PVN仅检测到2个细胞，SON和SOR无阳性）。由于小细胞AVP神经元已知共表达CRH，研究人员在CRH-Venus敲入小鼠中进一步分析：PVN中AVP-ir神经元与CRH阳性神经元无共定位，且AVP-ir纤维位于正中隆起内层，CRH阳性终末位于外层。这表明在本研究条件下，小细胞CRH神经元中的AVP表达水平低于检测阈值，因此所检测到的AVP-ir神经元主要为小细胞，且calbindin 1标记了其中一部分大细胞AVP神经元亚群，揭示大细胞AVP群体也存在分子异质性。
**4. 讨论与结论**
讨论部分总结指出，calbindin 1可作为大细胞OXT神经元的标志物，reelin则识别后部PVN中的一个小细胞OXT神经元亚群，而calbindin 1也标记了一部分大细胞AVP神经元。这些发现将此前在PVN中基于单细胞转录组学的分子区分扩展至BNST、SON和SOR。研究结论强调，calbindin 1和reelin的差异表达为区分OXT和AVP神经元亚群（至少包括4种类型：FG阳性并表达或不表达calbindin 1，FG阴性并表达或不表达reelin）提供了分子框架，为未来研究不同OXT和AVP神经元群体在内分泌及行为调控中的特定功能奠定了基础。
