《Neurochemistry International》：Tanshinone IIA alleviates cerebral ischemia-reperfusion injury by inhibiting pyroptosis: involvement of the KLF4/CHIP/NLRP3 pathway
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Zhenzhen Zhong|Zhilin Huang|Zhaoping Wu|Xiaoyan Nie|Ji Liang|Jun Wen|Xiaobo Zhang中南大学湘雅医学院常德医院神经内科（常德市第一人民医院），中国湖南省常德市人民路818号，415000摘要脑缺血/再灌
Zhenzhen Zhong|Zhilin Huang|Zhaoping Wu|Xiaoyan Nie|Ji Liang|Jun Wen|Xiaobo Zhang
中南大学湘雅医学院常德医院神经内科（常德市第一人民医院），中国湖南省常德市人民路818号，415000
摘要
脑缺血/再灌注损伤是缺血性中风中的关键病理过程。焦亡在脑缺血/再灌注损伤的发展中起着核心作用。NOD样受体蛋白3（NLRP3）炎性小体是引发焦亡的关键因素，与神经炎症密切相关。虽然丹参酮IIA能够降低NLRP3的表达，但它在中脑动脉闭塞/再灌注损伤过程中通过NLRP3介导的神经元焦亡中的作用仍不清楚。在本研究中，我们旨在评估丹参酮IIA对脑缺血/再灌注损伤的神经保护作用，并阐明其背后的分子机制。我们利用大鼠大脑中动脉闭塞/再灌注模型以及PC12细胞氧糖剥夺/复氧模型来研究相关机制。研究方法包括神经系统功能评分、西方印迹法、共免疫沉淀法、双荧光素酶报告基因检测、染色质免疫沉淀法以及环己亚胺追踪实验。丹参酮IIA显著改善了MCAO/R大鼠的神经系统功能，减少了脑梗死体积，并减轻了神经元坏死。在PC12细胞中，丹参酮IIA对氧糖剥夺/复氧诱导的损伤具有明显的保护作用。从体外实验来看，丹参酮IIA可上调Krüppel样因子4（KLF4）的表达，进而转录激活Hsc70相互作用蛋白的羧基端。升高的CHIP表达似乎促进了NLRP3蛋白的泛素化及其蛋白酶体降解，从而抑制了NLRP3炎性小体的激活、caspase-1的切割以及白细胞介素IL-1β和IL-18的成熟，进而抑制了神经元焦亡。我们的研究结果表明，丹参酮IIA至少部分通过KLF4/CHIP/NLRP3相关机制缓解脑缺血/再灌注损伤，且这一途径在体外实验中得到了有力支持。不过，其在体内的直接因果关系仍有待验证。本研究为丹参酮IIA在脑缺血/再灌注损伤实验模型中的保护作用提供了证据。
引言
缺血性中风是一种以脑血流突然中断为特征的临床综合征，会导致脑组织局部缺血、缺氧及坏死，进而引发特定的神经系统功能障碍。由于其高发率、致残率和死亡率，该疾病给全球健康带来了沉重负担[1]。过去十年间，中风的发病率和死亡率分别上升了100.6%和32.3%[2]。预计到2030年，全球标准化年龄发病率将达到每10万人中有89.32例[3]。有研究显示，中风患者在出院后3年内有42.6%会出现残疾状况[4]，这表明中风是脑血管疾病导致长期残疾和死亡的重要原因。然而，目前有效的临床干预措施仍然有限[5]。因此，阐明缺血性中风的分子机制并开发针对性的治疗策略是当务之急。
脑缺血/再灌注损伤是缺血性中风发生和发展过程中的关键病理过程[6]。其发病机制十分复杂，目前尚未完全明确，涉及氧化应激、谷氨酸诱发的神经毒性、细胞内钙超载、炎症反应以及细胞凋亡等一系列事件[7]。其中，焦亡作为一种程序性促炎性细胞死亡形式，近年来受到了越来越多的关注。其特征是细胞肿胀、膜破裂以及细胞内物质释放，这些都会加剧局部炎症反应[8]。近期研究强调了焦亡在脑缺血/再灌注损伤中的核心作用[9]，而NOD样受体蛋白3则是神经元中这一过程的关键调控因子[10]。在脑缺血/再灌注损伤过程中，大脑中活化的NLRP3炎性小体数量增加，从而导致caspase-1被激活[11]。这会促使白细胞介素IL-1β和IL-18通过膜孔被切割并释放到细胞外，进一步加重局部炎症并引发焦亡[12]。因此，针对NLRP3炎性小体介导的焦亡途径进行治疗，可能是减轻脑缺血/再灌注损伤中炎症损害的有效策略。
NLRP3的活性和稳定性受到多种翻译后修饰的精细调控，其中泛素化起着至关重要的作用[13]。多种E3泛素连接酶可促进泛素化反应，这些连接酶会影响NLRP3的稳定性和降解程度，进而调控炎性小体的活性。作为多功能E3泛素连接酶，Hsc70相互作用蛋白的羧基端可通过调节蛋白质稳态和信号通路，参与多种疾病的生理和病理过程[14]。它还能通过抑制细胞坏死发挥保护作用[15]。不过，它是否通过促进NLRP3的泛素化及其降解来缓解脑缺血/再灌注损伤，目前尚无相关研究。
Krüppel样因子4是一种锌指结构转录因子，参与多种生物过程，包括DNA损伤响应、炎症反应、细胞凋亡以及干细胞重编程[16]。在脑缺血/再灌注损伤模型中，KLF4可能作为一种转录因子，参与调节缺血损伤后的星形胶质细胞反应[17]。KLF4还可通过调控硫氧还蛋白相互作用蛋白/NLRP3通路来调节溃疡性结肠炎中的焦亡现象[18]。不过，目前还不清楚KLF4是否是通过转录激活CHIP来发挥保护作用的。
丹参酮IIA是一种从传统中药丹参中提取的亲脂性化合物，具有抗凋亡、抗炎、抗氧化以及保护血脑屏障的作用19,20。与这些特性相符的是，丹参酮IIA已被证明可以有效减轻脑缺血/再灌注损伤[21]，并降低NLRP3蛋白的水平[22]。在心血管疾病模型中的研究表明，丹参酮IIA可通过上调KLF4的表达来抑制炎症反应和细胞增殖[23]。不过，目前尚不清楚丹参酮IIA是否通过KLF4表达来调节脑缺血/再灌注损伤细胞中的焦亡现象。为填补这一研究空白，本研究中我们采用了体内的大脑中动脉闭塞/再灌注模型以及体外的氧糖剥夺/复氧模型，旨在探究丹参酮IIA如何通过KLF4/CHIP/NLRP3信号通路抑制神经元焦亡，从而减轻脑缺血/再灌注损伤的分子机制。
章节节选
材料
丹参酮IIA购自美国新泽西州蒙茅斯琼奇的MedChemExpress LLC公司，其分子式为C19H18O3，分子量为294.34，纯度≥99.78%（产品编号：HY-N0135）。
动物
健康的雄性Sprague–Dawley大鼠（8周龄，体重250–300克）购自中国湖南湘南华大实验动物有限公司。所有大鼠均在无特定病原体条件下饲养，饲养环境温度为23±2℃，光照周期为12小时亮/12小时暗，可自由获取食物和水。这些大鼠
丹参酮IIA对OGD/R处理后的PC12细胞及原代大鼠海马神经元的保护作用
为在体外模拟脑缺血/再灌注损伤，我们使用了PC12细胞和原代大鼠海马神经元建立相应的模型。在进行氧糖剥夺/复氧处理之前，先用不同浓度（5、10和15微摩尔）的丹参酮IIA处理PC12细胞。CCK-8检测结果显示，与对照组相比，10微摩尔和15微摩尔浓度的丹参酮IIA都能提高OGD/R处理后细胞的存活率（见图1A）。因此，我们选择了最低有效浓度10微摩尔用于后续的机制研究。而原代大鼠海马神经元则
讨论
脑缺血/再灌注损伤是缺血性中风后导致神经系统功能恶化的关键病理过程，其发病机制涉及氧化应激、线粒体功能障碍以及炎症反应等多种相互关联的因素，最终会导致大量神经元死亡25,26。近年来，由炎性小体驱动的程序性细胞死亡形式——焦亡，已被认为是脑缺血/再灌注损伤病理过程中的重要因素[9]。在各种炎性小体成分中，NLRP3
结论
本研究结果表明，丹参酮IIA具有显著的神经保护作用，至少部分是通过抑制神经元焦亡来实现的。其作用机制在于上调KLF4的表达，而KLF4又能转录激活E3泛素连接酶CHIP的表达。升高的CHIP表达会促进NLRP3蛋白的泛素化及其随后的蛋白酶体降解，从而抑制NLRP3炎性小体的激活、caspase-1的切割，以及白细胞介素IL-1β和IL-18的成熟与释放
机构审查委员会声明
本动物实验方案已经过中南大学动物实验伦理委员会的审核批准（批准编号：CSU-2024-0372，批准日期：2024年12月10日）。所有实验大鼠都受到了人道的对待，且所有实验操作均符合美国国立卫生研究院的相关标准。
CRediT作者贡献说明
Zhenzhen Zhong：文章撰写——审稿与编辑、文章撰写——初稿撰写、方法学研究、资金筹集、数据分析、概念构思。Xiaobo Zhang：文章撰写——审稿与编辑、资金筹集。Jun Wen：项目监督、项目管理工作。Ji Liang：项目监督、项目管理工作。Xiaoyan Nie：实验研究、数据分析、数据整理。Zhaoping Wu：项目监督。Zhilin Huang：方法学研究、概念构思
数据可用性声明
本研究中的原始数据已收录在论文及补充材料中。如需进一步了解相关信息，可联系相应作者。
资助情况
本研究得到了国家重点临床专科科学研究项目（编号Z2023166、Z2023112）、湖南省自然科学基金（编号2024JJ7008、2024JJ7009）的资助。
利益冲突声明
? 作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。
致谢
我们感谢所有在实验过程中给予帮助和支持的实验室人员。所有作者均已对文章内容进行了审阅和修改，并对本文的内容承担全部责任。
