聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒释放的尿酸减轻谷氨酸诱导的脊髓神经元兴奋性毒性

《ASN Neuro》：Uric Acid Released from Poly (Lactic-co-Glycolic Acid) Nanoparticles Mitigates Glutamate-Induced Excitotoxicity of Spinal Cord Neurons

　　

脊髓损伤（SCI）常因谷氨酸诱导的兴奋性毒性（GIE）造成的继发性损伤而加剧，其中过量的谷氨酸释放通过过度刺激谷氨酸受体导致神经元损伤。此过程导致线粒体功能障碍、氧化应激和神经元死亡。尿酸（UA）因其抗氧化特性被确定为一种潜在的神经保护分子，但其有限的溶解性对临床应用构成了挑战。为解决此问题，研究人员采用改良的双乳化技术将尿酸封装于聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米颗粒（UA-NPs）中，以增强尿酸的稳定性和递送。对脊髓培养物施加谷氨酸诱导的兴奋性毒性，随后用UA-NPs或空纳米颗粒处理。通过神经元标记物微管相关蛋白2（MAP2）的免疫细胞化学评估神经元存活率，结果显示，与用空纳米颗粒处理的培养物相比，用UA-NPs处理可显著提高细胞存活率。这些发现表明，UA-NPs在体外对脊髓神经元具有神经保护作用，并可能作为一种有前景的局部药物递送系统用于脊髓损伤治疗，为减轻继发性损伤提供了一种靶向方法。

**研究背景与问题**
脊髓损伤（SCI）是一种破坏性的神经系统疾病，导致感觉、运动和自主功能紊乱，严重影响患者的生活质量。在美国，有超过100万脊髓损伤患者，且每年新增约18，000例。脊髓损伤的治疗极具挑战性，其病理过程分为两个阶段：原发性损伤（由机械性创伤直接导致）和继发性损伤。继发性损伤在原发性损伤后数小时至数月内发生，是导致神经功能进一步恶化的关键环节。其中，谷氨酸诱导的兴奋性毒性（GIE）是核心机制之一：损伤后神经元和星形胶质细胞释放过量的兴奋性神经递质谷氨酸，过度激活神经元上的谷氨酸受体（特别是N-甲基-D-天冬氨酸受体，NMDA受体），导致细胞内钙离子（Ca²⁺）超载。钙超载激活一系列破坏性酶类，引发线粒体功能障碍、活性氧（ROS）过量产生、氧化应激，最终导致神经元死亡。因此，靶向继发性损伤阶段，尤其是GIE，是改善脊髓损伤预后的重要治疗策略。

尿酸（UA）是嘌呤代谢的终产物，作为一种内源性抗氧化剂，在体外和体内研究中均显示出对兴奋性毒性的神经保护作用。其机制包括清除自由基、减轻氧化损伤，以及通过上调星形胶质细胞的EAAT-1谷氨酸转运体来增强谷氨酸的摄取，从而降低细胞外谷氨酸浓度。然而，尿酸作为治疗剂面临两大挑战：一是其水溶性差，在生理溶液（如血液）中溶解有限，影响其生物利用度和向损伤部位的递送；二是全身性给药可能导致高尿酸血症，引发痛风、肾病和高血压等副作用。因此，开发一种能够局部、持续递送尿酸，同时避免全身性副作用的新型给药系统至关重要。

**研究目的与意义**
本研究旨在开发一种基于聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米颗粒的尿酸局部递送系统（UA-NPs），并评估其在体外脊髓神经元谷氨酸兴奋性毒性模型中的神经保护功效。研究的意义在于探索一种能够克服尿酸自身局限性、实现靶向和持续给药的新型纳米治疗策略，为减轻脊髓损伤后继发性神经元损伤提供潜在的创新疗法。本研究发表在《ASN Neuro》期刊上。

**关键技术方法概述（不超过250字）**
研究人员采用改良的双乳化技术制备了负载尿酸的PLGA纳米颗粒（UA-NPs）以及作为对照的空载纳米颗粒（empty-NPs）。通过透射电子显微镜（TEM）表征了纳米颗粒的形貌与尺寸分布。使用Amplex Red尿酸/尿酸酶检测试剂盒测定了UA-NPs的载药效率以及尿酸在生理缓冲液中的稳定性（降解动力学）。通过体外释放实验，在37°C的Tris-HCl缓冲液中监测了UA-NPs中尿酸的释放动力学，并利用MATLAB软件对释放曲线和降解动力学进行数学建模。研究使用来源于孕16天（E16）Sprague Dawley大鼠胚胎的脊髓神经元进行体外培养，建立了谷氨酸诱导的兴奋性毒性模型。通过免疫细胞化学方法，使用抗微管相关蛋白2（MAP2）抗体标记神经元，并计数MAP2阳性神经元来定量评估神经元存活率。所有统计分析使用GraphPad Prism 10软件进行。

**研究结果**
**3.1. 谷氨酸处理导致脊髓培养物中MAP2阳性神经元丢失**
为模拟脊髓损伤后的继发性损伤，研究人员在脊髓培养物中进行了谷氨酸损伤的剂量反应研究。用不同浓度（0-750 μM）的谷氨酸处理培养物1小时后，通过计数MAP2阳性神经元评估24小时后的神经元存活率。结果显示，与未损伤对照组相比，所有测试浓度的谷氨酸（≥50 μM）均导致神经元存活率显著下降，证实了谷氨酸诱导的兴奋性毒性模型的有效性。基于此，后续实验选择50 μM谷氨酸作为标准损伤浓度。

**3.2. 尿酸处理不影响脊髓神经元存活**
为评估尿酸本身的细胞毒性，研究人员用不同浓度（0-500 μM）的尿酸处理脊髓神经元培养物1小时。24小时后评估发现，高达500 μM的尿酸处理并未影响MAP2阳性神经元的数量，表明在该浓度范围内尿酸对脊髓神经元无毒性。因此，后续神经保护实验选择了100 μM和200 μM这两个无毒且生理相关的尿酸浓度。

**3.3. 尿酸减轻脊髓培养物中的谷氨酸诱导的毒性**
研究人员测试了两种给药方案下尿酸的神经保护作用。第一种方案是神经元同时暴露于谷氨酸和尿酸（或载体）1小时；第二种方案是神经元先暴露于谷氨酸1小时，随后再更换为含尿酸的恢复培养基处理24小时。结果表明，在两种方案下，与仅用谷氨酸处理的组相比，加入尿酸（100 μM或200 μM）均能显著减轻谷氨酸诱导的神经元死亡。重要的是，即使在谷氨酸损伤结束后再给予尿酸，仍能提供有效的神经保护，这更具生理相关性，支持了尿酸在减轻继发性损伤中的治疗潜力。

**3.4. 透射电子显微镜显示空载纳米颗粒和UA-NPs的尺寸分布适用于生物应用**
TEM分析显示，负载尿酸的纳米颗粒（UA-NPs）的平均直径（260.8 ± 8.48 nm）显著大于空载纳米颗粒（empty-NPs，154.6 ± 1.71 nm）。尽管载药增大了纳米颗粒尺寸，但两者均处于生物医学应用的最佳尺寸范围内。

**3.5. 尿酸被高效载入PLGA纳米颗粒**
通过测量上清液中未包封的尿酸浓度，计算出UA-NPs的载药效率平均高达88.19% ± 0.14%，表明制备方法能高效、稳定地将尿酸封装入PLGA纳米颗粒中。

**3.6. 尿酸在7天内发生降解**
研究人员评估了尿酸在37°C生理缓冲液中的稳定性。结果显示，在7天内，不同起始浓度（50， 100， 200 μM）的尿酸降解率在38.22%到51.49%之间。MATLAB建模表明，尿酸的降解符合一级动力学模型，且采用分段函数（0-2天和2-7天）能更好地拟合降解数据。

**3.7. 重悬的UA-NPs释放显示出与时间依赖性释放相对应的不同阶段**
对UA-NPs的体外释放动力学研究表明，尿酸的释放呈双相模式。在纳米颗粒重悬后立即出现一个初始的突释阶段，随后在1-3天内释放速率低于降解速率，导致测得的缓冲液中尿酸浓度下降。MATLAB建立的数学模型成功拟合了实验数据，并预测了不同纳米颗粒浓度下（1.8-3.6 mg/mL）一周内的尿酸浓度变化曲线。

**3.8. 损伤后使用UA-NPs处理可保护神经元免受谷氨酸诱导的兴奋性毒性**
这是本研究的关键发现。在脊髓神经元遭受50 μM谷氨酸损伤1小时后，分别用空载纳米颗粒（empty-NPs）或UA-NPs处理24小时或48小时。通过MAP2阳性神经元计数评估发现，与损伤后使用empty-NPs处理的组相比，使用UA-NPs处理的组在24小时和48小时两个时间点均表现出显著更高的神经元存活率。同时，empty-NPs本身在对照组或损伤组中均未引起额外的细胞死亡。这些数据直接证明，从纳米颗粒中释放的尿酸能够有效保护神经元免受谷氨酸兴奋性毒性的损害。

**讨论与结论**
**讨论部分总结**：
本研究证实了负载尿酸的PLGA纳米颗粒（UA-NPs）在体外能有效减轻谷氨酸诱导的脊髓神经元兴奋性毒性。研究结果与先前关于可溶性尿酸神经保护作用的研究一致，并拓展了利用生物材料（如之前研究的UA-聚己内酯纤维）进行局部给药的理念。与其他用于脊髓损伤的小分子神经保护剂（如甲基强的松龙、铁死亡抑制剂、槲皮素、利鲁唑等）相比，尿酸具有内源性、已报道的氧化还原活性及在人体试验中显示的安全性等优势。PLGA作为一种已被美国FDA批准、生物相容性良好且降解速率可调的聚合物，是理想的药物递送载体。本研究观察到UA-NPs的双相释放模式，初始突释可能源于表面吸附尿酸的快速解离，而后续的持续释放则与药物从纳米颗粒基质中的扩散有关。尿酸在生理条件下的部分降解提示，需要通过控制释放动力学来维持损伤部位的有效治疗浓度。局部给药策略（如鞘内注射）或结合可注射水凝胶，是未来将UA-NPs转化为临床应用的潜在方向。关于作用机制，先前研究表明尿酸的神经保护作用并非通过直接结合谷氨酸实现，而是依赖于星形胶质细胞的存在，通过上调EAAT-1谷氨酸转运体来增强谷氨酸摄取，从而间接减轻兴奋性毒性。本研究中UA-NPs的保护效应可能也涉及类似的间接机制。

**结论部分翻译**：
总之，我们的研究强调了UA-NPs作为脊髓损伤新型治疗方法的潜力。PLGA纳米颗粒的生物相容性、安全性和可调特性为尿酸递送提供了一个强大的平台，能够有效减少由谷氨酸诱导的兴奋性毒性引起的神经元死亡。UA-NP处理观察到的对脊髓神经元的显著神经保护作用，支持UA-NPs作为脊髓损伤的可行干预措施。这些发现为尿酸在损伤后具有神经保护作用这一不断增长的证据体系做出了贡献，并强调了创新生物材料对于脊髓损伤治疗的重要性。未来的方向将集中于优化纳米颗粒配方，并将这些发现转化为临床相关模型，以满足脊髓损伤患者未满足的治疗需求。