降低PI4KIIIα水平或活性限制人类皮层神经元中Tau种子内化和组装

《Cells》：Reducing PI4KIIIα Levels or Activity Limits Tau Seed Internalization and Assembly in Human Cortical Neurons

　　

Tau蛋白聚集和传播是阿尔茨海默病和额颞叶痴呆等神经退行性疾病的核心特征。研究人员在此研究了磷脂酰肌醇4-激酶IIIα型（PI4KIIIα）在调控tau传播中的作用。首先使用tau生物传感器细胞，证明药物抑制和基因降低PI4KIIIα均可有效减少由细胞外种子引发的tau聚集播种。为将这些发现扩展到更生理相关的系统，研究人员生成了携带致病性MAPT突变的诱导多能干细胞（iPS细胞）源性皮层神经元。这些神经元迅速获得tau病相关特征，包括表达疾病相关异构体如4R tau，从而在体外实现了tau病理的建模。利用该模型，研究人员建立了监测tau传播和聚集的表型分析，并将其应用于测试候选小分子。值得注意的是，抑制PI4KIIIα在人类神经元中持续减少了tau组装体的播种，凸显该激酶在tau病理播种中的关键作用。总体而言，研究人员的工作将PI4KIIIα鉴定为tau病理的调节因子，并提供了新的实验平台来解析tau传播的分子机制。这些发现为开发减缓或预防中枢神经系统中tau介导的神经退行性变策略开辟了潜在途径。

**论文解读：PI4KIIIα调控tau种子内化与组装在人类皮层神经元中的机制研究**

**研究背景与问题**

Tau蛋白病（tauopathies）是一类常见的神经退行性疾病，以Tau蛋白异常聚集并在脑内传播为特征，涉及阿尔茨海默病、额颞叶痴呆等多种疾病。Tau蛋白由MAPT基因编码，其聚集物（种子）可在神经元间以类朊病毒样方式传播，导致病理进展。目前，抑制tau种子内化和聚集被视为延缓疾病进展的潜在策略。然而，tau种子进入细胞的分子机制尚不完全清楚。磷脂酰肌醇4-激酶IIIα型（PI4KIIIα）是合成质膜上磷脂酰肌醇4-磷酸（PI(4)P）的关键酶，进而生成磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PI(4,5)P₂），后者在网格蛋白介导的内吞及非网格蛋白依赖性内吞中起重要作用。已有研究表明，抑制PI4KIIIα可阻断多种外源病原体（如埃博拉病毒、丙型肝炎病毒）的进入和复制。基于此，研究人员提出假设：PI4KIIIα可能调控外源性tau种子的内化及随后的聚集，从而成为tau病理传播的潜在干预靶点。该研究旨在验证这一假设，并在人类神经元模型中评估PI4KIIIα抑制对tau种子内化和组装的影响。论文发表在《Cells》。

**主要关键技术方法**

研究人员采用以下关键技术：1）Tau生物传感器细胞（人胚肾HEK293T细胞系，表达荧光标记的tau重复域TauRD P301S，用于定量检测tau种子诱导的聚集）；2）siRNA敲低PI4KIIIα（靶向PI4KA基因）以验证靶点特异性；3）多种PI4KIIIα小分子抑制剂（包括GSK-F1、GSK-A1、PIK93、IN-9、IN-10等）进行药理学干预；4）诱导多能干细胞（iPS细胞）基因编辑（插入NGN2诱导表达盒）并分化为皮层神经元，所使用的iPS细胞系携带MAPT突变（IVS10+16和P301S，来自欧洲iPS细胞库EBiSC），以建立更生理相关的tau病理模型；5）pHrodo荧光标记tau种子用于活细胞内化成像（pH敏感探针，标记内吞进入酸性区室的种子）；6）均相时间分辨荧光（HTRF）技术检测内源性tau组装体（利用抗体识别tau蛋白富含脯氨酸区域，仅检测由内源性tau形成的聚集，排除外源种子干扰）。

**研究结果**

**3.1 PI4KIII作为抑制tau病理播种的新靶点：** 在tau生物传感器细胞中，PI4KIIIα抑制剂GSK-F1和IN-9以剂量依赖方式显著减少tau种子诱导的聚集（降低约90%），而主要抑制PI4KIIIβ的抑制剂（如PIK93、IN-3）仅在高于1μM浓度（即抑制PI4KIIIα的浓度）时有效，提示PI4KIIIα而非PI4KIIIβ是关键靶点。

**3.2 PI4KIIIα敲低减少tau播种：** 通过siRNA将PI4KIIIα蛋白水平降低约75%，可导致tau生物传感器细胞中聚集形成减少超过50%，与药物抑制结果一致，进一步验证PI4KIIIα在种子诱导聚集中的必要性。

**3.3 PI4KIIIα抑制减少全长tau纤维的播种活性：** 使用全长2N4R tau（FL-tau）纤维作为种子，GSK-F1同样以剂量依赖方式抑制聚集，但效果较K18截短纤维略弱，表明PI4KIIIα的作用不限于截短tau。

**3.4 PI4KIIIα抑制减少细胞内FL-tau种子水平：** 在HEK293T细胞中，GSK-F1处理6小时后，荧光标记的FL-tau-488纤维的细胞内点状信号显著减少，提示PI4KIIIα抑制可能通过降低tau种子内化来减少聚集。

**3.5 诱导多能干细胞源性皮层神经元模型建立：** 通过基因编辑将NGN2诱导表达盒插入iPS细胞AAVS1安全港位点，并分化为皮层神经元。携带MAPT突变的神经元（MAPT-Mut）在分化第30天表达高水平4R tau，并表现出98%分化效率（表达FOXG1和TUBB3），为种子诱导的tau组装检测提供了合适模型。

**3.6 PI4KIIIα抑制减少iPS细胞源性皮层神经元中外源tau种子水平：** 在未使用转染试剂的情况下，将pHrodo标记的FL-tau种子直接加入神经元培养基。GSK-A1（0.1μM）处理6小时后，细胞内pHrodo阳性点状信号（位于溶酶体/晚期内体）显著减少，且溶酶体数量未受影响，提示PI4KIIIα抑制降低了tau种子进入酸性区室的量。

**3.7 外源种子诱导iPS细胞源性皮层神经元tau病理：** 使用K18(P301L)种子（不包含HTRF抗体识别表位）处理MAPT-Mut神经元10天后，HTRF信号显著升高，表明内源性tau形成了组装体；而MAPT-WT神经元无变化，证实该信号反映由内源性tau聚集所致，且依赖4R tau表达。

**3.8 PI4KIIIα抑制剂GSK-A1减少人类皮层神经元tau病理诱导：** 在MAPT-Mut神经元中，预处理24小时（而非6小时）的GSK-A1（0.1μM）可显著降低HTRF信号，即减少内源性tau组装；而GSK-F1（1μM）虽未达到统计学显著，但趋势一致，与GSK-A1更高的PI4KIIIα抑制效力相符。

**讨论与结论**

讨论部分指出，PI4KIIIα抑制剂减少tau播种的可能机制是降低外源tau种子的内化效率，因为PI4KIIIα负责生成PI(4)P，进而合成PI(4,5)P₂，后者在网格蛋白介导的内吞中起关键作用。但也不能排除其他机制，如种子降解或内源性tau水平调控。此外，该iPS细胞模型存在局限性，如神经元相对不成熟，且HTRF信号可能反映寡聚体而非成熟纤维，需进一步验证。关于治疗转化，完全抑制PI4KIIIα在体内可导致毒性（如胃肠道和心血管毒性），但部分抑制（如杂合缺失或变构抑制）可能安全且有效，例如变构PIKfyve抑制剂apilimod在多种模型中耐受性好且具神经保护作用。结论部分明确：PI4KIIIα调控生物传感器细胞和人类iPS细胞源性皮层神经元中种子诱导的tau聚集，这种减少与内化tau种子水平降低相关。需要进一步实验确定该观察是源于摄取减少、降解增加还是加工改变。未来工作需克服PI4KIIIα抑制相关的毒性。