《International Journal of Molecular Sciences》：Off-Target-Based Tumor Fraction Estimation from Targeted Sequencing Shows Concordance with Orthogonal Methods Across Advanced Solid Tumors
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循环肿瘤DNA分数（ctFraction)已成为评估肿瘤负荷和监测癌症患者治疗反应的重要生物标志物。在本研究中，研究人员比较了ichorCNA、Fragle低通全基因组测序(Fragle LP-WGS)、Fragle脱靶法和OTTER（Tempus AI公司专
循环肿瘤DNA分数（ctFraction)已成为评估肿瘤负荷和监测癌症患者治疗反应的重要生物标志物。在本研究中，研究人员比较了ichorCNA、Fragle低通全基因组测序(Fragle LP-WGS)、Fragle脱靶法和OTTER（Tempus AI公司专有算法）生成的ctFraction估算值。研究人员对33例晚期实体瘤患者的血浆样本进行了ctDNA检测，该检测靶向150个癌症相关基因，并比较了不同方法生成的ctFraction估算值。Fragle脱靶法与Fragle LP-WGS的一致性最高（rho = 0.903），其次为OTTER（rho = 0.698）和ichorCNA（rho = 0.696），而OTTER与ichorCNA之间显示出高度一致性（rho = 0.826）。平均变异等位基因频率(mVAF)与所有ctFraction估算值均显著相关，其中与ichorCNA的关联最强（rho = 0.910），其次为OTTER（rho = 0.865）、Fragle LP-WGS（rho = 0.680）和Fragle脱靶法（rho = 0.658）。对20例患者在基线期和两个疗程治疗后的纵向分析显示，ctFraction变化量(ΔctFraction)与平均ΔVAF之间均存在强相关性，其中ichorCNA和Fragle脱靶法的结果分别为r = 0.955和r = 0.906。总体而言，这些发现表明，基于拷贝数变异和片段组学方法的ctFraction估算值在晚期实体瘤中显示出高度一致性，并与mVAF（ctDNA丰度的常用测量指标）显著相关。Fragle脱靶法尤其提供了一种直接从现有靶向测序数据中进行ctFraction估算的有效策略，无需额外的测序。需要更大规模的前瞻性研究来进一步评估Fragle脱靶法在治疗监测和结局预测中的临床效用。
【研究背景与问题】
循环肿瘤DNA（ctDNA）是肿瘤细胞释放入外及其他体液的游离DNA(cfDNA)成分，携带肿瘤特异性遗传改变，仅占个体总cfDNA的很小比例。与健康个体相比，晚期癌症患者的ctDNA来源于原发肿瘤和转移灶，且片段更短， modal片段大小约为146 bp，而正常细胞来源的cfDNA约为166 bp。ctDNA半衰期短（16分钟至2.5小时），能够实现治疗反应和临床结局的实时评估，即"分子反应"。近年来，ctDNA作为癌症诊断、监测、复发早期检测和治疗监测的稳健生物标志物，显示出比传统影像学更早的预警时间。ctFraction（循环肿瘤分数）代表肿瘤来源DNA占总cfDNA的比例，其水平受肿瘤类型、位置、分期、肿瘤负荷和治疗反应等因素影响。目前已开发出多种从二代测序(NGS)数据估算ctFraction的算法，包括ichorCNA、Fragle和OTTER等。ichorCNA通过检测大规模拷贝数变异(CNAs)和非整倍体来估算ctFraction，但需要低通全基因组测序(LP-WGS)，不适用于临床常规使用的靶向panel；片段组学(fragmentomic)是液体活检中的新兴领域，Fragle是基于深度学习的方法，可通过分析cfDNA片段长度分布来量化ctDNA水平，既能应用于LP-WGS数据（Fragle LP-WGS），也能应用于深度靶向测序产生的脱靶读数（Fragle脱靶法）；OTTER是Tempus AI公司开发的专有算法，整合体细胞变异等位基因频率(VAFs)和CNAs来估算ctFraction，但完整算法未公开披露。此外，肿瘤相关变异的VAFs也可用于近似ctDNA水平，但并非所有肿瘤都携带给定靶向测序panel覆盖的突变，且该方法区分生殖系变异和意义未明的克隆性造血(CHIP)的能力有限。因此，开发能从现有靶向测序数据中直接获取ctFraction的方法具有重要的临床意义。
【研究设计与主要结论】
研究人员纳入33例晚期实体瘤患者（包括非小细胞肺癌、黑色素瘤、食管癌、结肠腺癌、直肠腺癌和乳腺癌），使用经验证的150基因FCCC ctDNA检测进行基因组分析。同时，分离的cfDNA和配对基因组DNA(gDNA)用于区分生殖系变异和CHIP相关变异。研究比较了ichorCNA、Fragle LP-WGS、Fragle脱靶法三种算法生成的ctFraction估算值，并与Tempus xF 105基因检测的OTTER估算值进行了对比。此外，研究还对20例患者的基线期和两个治疗周期后样本进行了纵向分析，评估ctFraction变化与VAF变化的关系。
主要结论显示：Fragle脱靶法与Fragle LP-WGS的一致性最高（Spearman rho = 0.903），证实了脱靶读数作为LP-WGS替代方案的可靠性；ichorCNA和OTTER与Fragle脱靶法的中等强度相关性（rho分别为0.696和0.698）反映了片段组学、CNA和突变定量方法之间的方法学差异；所有ctFraction估算值均与mVAF显著相关，ichorCNA相关性最强（rho = 0.910）；纵向分析中，ichorCNA和Fragle脱靶法的ΔctFraction与平均ΔVAF之间均存在强相关性（Pearson r = 0.955和0.906），且与影像学改善一致。研究发表于《International Journal of Molecular Sciences》。
该研究的重要发现是 valuable 价值在于：Fragle脱靶法允许直接从现有靶向测序数据中获取ctFraction，无需额外的LP-WGS测序，可降低测序成本、样本需求和工作流程复杂性，为精准肿瘤学中的早期反应评估和纵向疾病监测提供了具有成本效益的突变非依赖性ctDNA定量策略。
【关键技术方法】
研究样本来自Fox Chase癌症中心42例晚期实体瘤患者，包括33例单样本队列和20例纵向队列（其中11例重叠）。血液采集于cell-free DNA BCT STRECK管，经两次离心分离血浆，使用QIAamp MinElute ccfDNA Midi试剂盒提取cfDNA，Qubit 4荧光计定量；白细胞gDNA使用QIAamp DNA Blood Mini试剂盒提取。FCCC ctDNA检测为150基因靶向杂交捕获Panel（约0.645 Mb），覆盖SNV和indel，使用Illumina cfDNA Prep with Enrichment试剂盒建库，加入分子标签(UMIs)纠错，NextSeq 2000测序～4200×覆盖度。数据分析使用DRAGEN ILMN cfDNA Prep with Enrichment App v.4.0.3，VarSeq Suite进行三级分析，通过配对正常样本区分体细胞、生殖系和CHIP变异。Fragle脱靶法使用靶向测序的脱靶读数；ichorCNA和Fragle LP-WGS使用保留的37.5 μL预捕获文库经两次PCR扩增后行0.5×–1× LP-WGS。Tempus xF为外部105基因检测，OTTER为v0.3版专有算法。统计分析使用Spearman秩相关评估ctFraction方法间关系，Bland–Altman分析评估一致性，Pearson相关评估纵向变化线性关系。
【研究结果】
2.1 33例实体瘤患者的ctFraction研究队列
该队列包含13例非小细胞肺癌、6例黑色素瘤、1例食管癌、3例结肠腺癌、1例直肠腺癌和9例乳腺癌患者。28例为病理IV期，5例为III期。FCCC ctDNA检测中位唯一覆盖深度4246×，共鉴定出18个生殖系变异、17个CHIP变异和156个体细胞变异。87.9%的患者（29/33）检测到体细胞变异，TP53最为常见（45%，15/33），BRAF变异6例（18%），其中4例黑色素瘤为Tier 1变异；PTEN变异5例（15%），TERT变异5例黑色素瘤（15%），KRAS Tier 1变异4例（12%）。4例携带致病或可能致病生殖系变异：2例MUTYH变异，1例BRCA1变异，1例ATM变异。30.3%（10/33）携带1-3个CHIP变异，2例高龄患者（86岁和80岁）的CHIP相关致癌变异VAF约为40%。
2.2 ctFraction估算值与平均VAF
三种算法的ctFraction估算值与OTTER进行比较。Fragle LP-WGS与Fragle脱靶法一致性最高（rho = 0.903，p < 0.001）。Fragle脱靶法与ichorCNA（rho = 0.696，p < 0.001）、OTTER（rho = 0.698，p < 0.001）为中等到强相关性。OTTER与ichorCNA相关性强（rho = 0.826，p < 0.001）。Bland–Altman分析显示，Fragle LP-WGS与Fragle脱靶法平均偏差最小（2.77%），95%一致性界限最窄（-3.99%至9.54%）；其他比较一致性界限较宽，尤其是高肿瘤分数时差异更大，表明方法不可直接互换。mVAF与所有ctFraction估算值显著相关，ichorCNA最强（rho = 0.910），其次OTTER（rho = 0.865）、Fragle LP-WGS（rho = 0.680）和Fragle脱靶法（rho = 0.658）。Fragle脱靶法在多数样本中返回最高ctFraction估算值，OTTER最低。结肠直肠癌和乳腺癌患者的ctFraction和mVAF普遍高于黑色素tmlanoma、肺癌和食管癌Pt.21（结肠腺癌IV期）的ctFraction和mVAF最高，该患者确诊后1年死于疾病。
2.3 治疗过程中的ctFraction和VAF变化
20例患者（6例肺腺癌、8例乳腺癌、6例结直肠癌CRC）的纵向队列中，5例未检测到体细胞变异。ΔctFraction与平均ΔVAF强相关，ichorCNA（rho = 0.805）和Fragle脱靶法（rho = 0.702）。Pearson相关分别为r = 0.955（ichorCNA）和r = 0.906（Fragle脱靶法）。Pt.9、21、25、32的ctFraction估计值（约-10%至-50%）和mVAF（-5%至-50%）下降最显著，与CT影像学改善一致，分别接受osimertinib（EGFR TKI）、alpelisib联合fulvestrant、docetaxel联合曲妥珠单抗和pertuzumab、FOLFOX联合bevacizumab治疗。
【讨论与结论】
研究人员指出，ctFraction作为泛癌种生物标志物具有重要的预后价值，可用于预测多种晚期癌症的core生存率。低ctFraction可能影响液体活检的检出敏感性，尤其是CNA、基因融合和低VAF突变。然而，大多数ctFraction估算方法与靶向测序数据不兼容，因其需要LP-WGS或DNA甲基化数据。Fragle脱靶法利用靶向测序中通常丢弃的脱靶读数（广泛分布于基因组，可近似LP-WGS覆盖度），直接从现有靶向测序数据中实现ctDNA定量，无需单独LP-WGS。
该研究与Zhu等开发的Fragle算法结果一致：Fragle脱靶法与Fragle LP-WGS高度一致，支持脱靶读数作为LP-WGS的可靠替代。OTTER通常报告较低的ctFraction值，样本间变异性较大。ichorCNA与Fragle方法之间存在系统偏差，ichorCNA倾向于低估肿瘤分数，尤其在低脱落样本中。Fragle的检测下限(LoD)为1%，优于ichorCNA的3%；在62个cfDNA样本中，ichorCNA 26次估算ctFraction为零，而Fragle脱靶法检测到可测量的肿瘤分数，显示片段组学方法可捕捉CNA方法遗漏的微弱肿瘤信号。Finkle等报道OTTER敏感性高于ichorCNA，本研究也观察到类似现象。
mVAF与ichorCNA和OTTER的线性关联最强，可能因为这些方法分别依赖CNA和突变信号，与mVAF的生物学基础更为接近。Fragle脱靶法虽与mVAF仅中等相关，但这种相对独立性恰恰反映了其优势：片段组学信号遍布基因组，可检测极低水平的ctDNA，即使在突变负荷低的样本中。然而，低ctDNA水平时假阳性风险增加，应结合正交分子发现、配对体细胞变异数据、影像学发现和纵向趋势综合判断。
分子反应目前缺乏统一的定量定义。本研究采用差值求和法计算平均ΔVAF，对每个体细胞变异等权重处理，降低单一突变过度驱动总体反应估计的风险。Zhang等采用治疗后与基线mVAF比值<0.5定义分子反应；转移性乳腺癌CDK4/6抑制剂研究中，一个周期后mVAF比值<0.3与无进展生存期改善相关。TRIUMPH试验中， pelatuzumab联合曲妥珠单抗治疗后早期ctFraction下降与改善的无进展生存期和总生存期相关。
本研究局限性包括：技术重复未在ctFraction接近检测下限的样本中进行；低ctDNA或低生物量样本中随机取样效应可能影响估算可重复性；纵向队列样本量小、时间点少、基线ctFraction水平低，仅4/20例患者显示可测量的治疗反应一致性变化；影像学评估时间与ctDNA采血时间不完全匹配。
研究结论指出，Fragle脱靶法 demonstrating 与ichorCNA和OTTER established方法具有strong concord没有达到本输出小小保留一致性，可在无需额外LP-WGS的情况下从现有靶向测序数据中直接获取ctFraction估算值，降低测序成本和工作流程复杂性。虽然绝对ctFraction估算值因方法学差异而不可直接互换，但所有方法在患者分层中保持一致的ctDNA水平排序。需要更大规模的前瞻性、多中心研究和正式的分析性能评估，以确定Fragle脱靶法在不同患者群体和癌种中的临床有效性、可重复性和普适性，方可考虑用于常规临床或治疗决策。
