《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Time-resolved morphological and transcriptomic characterization of early enteric neuron subtype emergence in chick
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引导新生肠神经回路及其独特架构的遗传程序仍鲜有表征。为获得见解，研究人员结合了鸡胚模型中的操作、全肠三维（3D）成像以及极短间隔的单核转录组学（single-nucleus transcriptomics, snRNA-seq），用于神经元亚型轨迹的时间分辨分
引导新生肠神经回路及其独特架构的遗传程序仍鲜有表征。为获得见解，研究人员结合了鸡胚模型中的操作、全肠三维（3D）成像以及极短间隔的单核转录组学（single-nucleus transcriptomics, snRNA-seq），用于神经元亚型轨迹的时间分辨分析。在成像中，研究人员发现了高度动态的轴突网络生长，包括轴突密度的快速增加和空间定向多样化。在转录组水平上，研究人员将这些变化与特定轴突导向基因集的细胞状态转变相关联。与人和小鼠胚胎单细胞RNA测序（scRNA-seq）及表达谱的交叉分析揭示了所有物种中全局保守的肠神经元谱系轨迹和亚型特异性轴突导向程序。最后，在鸡全肠培养中对DSCAM和ISLR2进化保守网络的操纵改变了肠轴突模式，验证了研究人员的范式及其在推进当前人类肠回路布线知识方面的适用性。
**论文解读文章**
**研究背景与问题**
肠神经系统（enteric nervous system, ENS）的架构具有高度多样性，是其执行特定功能的基础。ENS由数百万神经元组成，包含多种亚型，这些亚型形成重复的神经节，分布于肌间丛和黏膜下丛中，并通过轴突网络相互连接，控制胃肠道运动、营养吸收、饱腹感等多种生理过程。ENS架构与功能的最佳关联在于食团推进的调节：感觉神经元检测食团，将信息传递给中间神经元，进而刺激上游的兴奋性运动神经元和下游的抑制性运动神经元，协调平滑肌的收缩与舒张。这一过程依赖于电路沿胃肠道三轴的拓扑组织，例如感觉神经元的径向轴突接触腔上皮，中间神经元的纵向轴突沿头尾方向延伸，而运动神经元的轴突则呈环向分布。
尽管ENS的发育序列已被广泛研究，但早期轴突亚型分化和在发育胃肠道内导航以构建电路架构的后续步骤仍知之甚少。迄今，儿科胃肠动力障碍主要归因于肠神经嵴细胞（enteric neural crest cells, ENCCs）未能定植某些区域导致无神经节症，如先天性巨结肠症（Hirschsprung disease, HD）。然而，切除无神经节段并不总能恢复正常动力，提示ENS电路的错误连接（miswiring）可能也是病因之一。因此，阐明引导轴突分化和电路架构建立的机制，可为这些疾病提供新的病因学假说。
**研究内容与意义**
本研究利用鸡胚模型，结合全肠三维成像、单核转录组学（snRNA-seq）及跨物种比较，系统表征了早期肠神经元亚型出现和轴突发育的动态过程。研究人员发现轴突网络在E4至E7期间高度动态生长，轴突密度和空间定向多样化，并与特定轴突导向基因集的细胞状态转变相关联。跨物种分析显示鸡、小鼠和人类之间保守的肠神经元谱系轨迹和亚型特异性轴突导向程序。通过操纵DSCAM和ISLR2两个保守的轴突导向受体基因，在离体全肠培养中改变了肠轴突模式，验证了研究范式的有效性。该研究发表在《Proceedings of the National Academy of Sciences》（PNAS），为理解人类肠回路布线机制及相关疾病提供了新视角。
**主要技术方法**
1. **体内电穿孔标记**：对E1.5鸡胚迷走神经嵴细胞进行体内电穿孔，表达荧光报告基因（GFP），实现神经元形态的稀疏标记。
2. **全肠三维成像**：结合免疫标记和HCR RNA-FISH，使用共聚焦和光片显微镜（light sheet microscopy）对E4至E7鸡胚预脐段肠管（preumbilical intestine, p-UI）进行成像，并通过Imaris软件进行三维形态追踪和轴突角度测量。
3. **单核RNA测序**：从E5、E6、E7鸡胚p-UI新鲜冷冻组织制备单核，进行snRNA-seq（10x Genomics平台），经Cell Ranger和Seurat分析，鉴定细胞簇并分析差异表达基因。
4. **离体全肠培养与蛋白处理**：将E4鸡胚全肠固定在硅胶培养皿中培养24小时，添加可溶性DSCAM或VASN蛋白，通过Tuj1免疫标记评估轴突网络和定向指数。
5. **跨物种比较分析**：利用公开的人类（6-11周）和小鼠（E12.5-E14.5、E15.5）胚胎scRNA-seq数据集，进行标签转移（label transfer）和差异表达分析，鉴定保守的轴突导向基因。
**研究结果**
**1. 鸡胚早期神经元分化和轴突发育的步骤**
通过HuC/D（神经元标记）和Tuj1（β3-微管蛋白）免疫标记，发现E4时p-UI已有神经元指定并伸出突起。从E4到E7，神经元密度逐步增加（E5至E6增加5.3倍），轴突网络复杂化，Tuj1阳性表面在E4至E5间增加>3.7倍。轴突在不同发育阶段呈现不同方向：E4以纵向为主（79%），至E5纵向降至45%，环向增加至55%，表明轴突轨迹多样化。
**2. 单核RNA-seq捕获鸡胚早期ENS神经元多样性**
对E5、E6、E7 p-UI进行snRNA-seq，通过无监督聚类鉴定出ENCCs、神经母细胞、神经元及早期胶质细胞簇。ENS细胞比例从E5的5.27%增至E7的15.05%。神经元分为两个分支：ETV1分支（ETV1.1、ETV1.2、ETV1.3）和BNC2分支（单个簇BNC2），后者主要在E6出现。ETV1.1表达NOS1（氮能神经元），ETV1.3表达VACHT（胆碱能神经元）。跨物种分析（人类、小鼠）显示早期神经元分化的二元命运（ETV1/BNC2）保守，且各簇存在转录相似性：鸡ETV1.1对应人类A1/小鼠抑制性运动神经元，ETV1.2/ETV1.3对应中间神经元和IPANs，BNC2对应兴奋性运动神经元。
**3. SnRNA-seq识别早期分化肠神经元的轴突导向基因程序**
基因集富集分析（GSEA）显示，神经元中“神经元突起发育”通路显著富集（NES=1.73）。研究人员构建了包含160个受体和细胞粘附分子的自建列表，发现57个基因在神经元中上调（如CELSR3），47个在ENCCs中上调（如EDNRB、Frizzled受体）。细胞通讯分析（CellChat）预测神经元与其他肠道细胞类型之间的多种配体-受体相互作用，包括SLIT和SEMA3信号。
**4. 轴突轨迹复杂化与具有特定导向信号特征的神经元类型多样化相关**
通过GFP电穿孔标记和三维追踪，量化E4至E6轴突方向变化。差异表达分析显示29个轴突导向受体基因在E5、E6、E7间受调控，其中9个富集于ETV1.3和BNC2簇。各神经元簇具有独特的轴突导向受体组合，如DSCAM和EFNA5限于ETV1.2/ETV1.3，BMPR1B限于ETV1.3，MET限于ETV1.2，GFRA2和PLXNA2限于BNC2。这些特征随阶段呈现有限的时间调控。
**5. ISLR2和DSCAM在轴突形成神经元中表达并可参与多种交互**
ISLR2（又名Linx）和DSCAM在E5和E6的NEFM阳性神经元中高表达（ISLR2: 77% at E5, 78% at E6；DSCAM: 30% at E5, 50% at E6）。ISLR2的配体包括VASORIN（VASN），受体包括RET、NTRK1、ROBO1；DSCAM可结合NCAM、Slits、Netrins等。HCR RNA-FISH结合GFP标记显示，69%的ISLR2阳性神经元具有纵向轴突，显著高于对照群体（45%），且这些神经元主要归属ETV1.2和ETV1.3簇。
**6. 保守和物种特异性的转录组程序引导轴突发育**
跨物种比较显示，鸡、小鼠、人类ENCC向神经元转变过程中，轴突导向基因表达变化显著，74%（小鼠）和66%（人类）的神经元上调基因也在鸡中上调，包括22个共有基因（如NCAM2、CELSR3、DSCAM、ISLR2）。亚型特异性分析发现，各物种神经元簇表达特定轴突导向受体/粘附分子，如ETV1.3簇中BMPR1B、PCDH7、CNTN1保守，BNC2簇中GFRA2、ROBO2保守。ISLR2在三个物种中均局限于ETV1分支，并在人类胎儿肠8周和12周样本中验证了其在纵向轴突中的表达。
**7. ISLR2和DSCAM促进鸡肠轴突发育**
离体全肠培养添加可溶性VASN或DSCAM后，Tuj1阳性表面分别增加1.95倍和1.78倍，但神经元数量无显著变化。轴突定向指数显示，蛋白处理使纵向轴突比例显著下降（FC: 0.41 vs. DSCAM: -0.05, VASN: -0.08），提示ISLR2和DSCAM参与轴突定向。
**总结与结论**
讨论部分总结：本研究表明，ENCC向神经元转变伴随着深刻的转录组变化，轴突导向受体库的转换使神经元获得对导向信号的响应能力，反映了轴突轨迹多样化的复杂性。ISLR2阳性神经元主要伸出纵向轴突，与其中间神经元身份一致。功能实验提示ISLR2和DSCAM网络影响肠轴突模式的形成。跨物种比较鉴定了保守的亚型特异性轴突导向基因，其中多个基因（GFRA1、GFRA2、NTRK3、CNTN1、BMP信号）的突变小鼠模型显示ENS异常，而DSCAM和ISLR2的人类变体与先天性巨结肠症或腹胀相关，支持这些基因在人类ENS病理生理学中的相关性。
研究结论：本研究的整体发现为控制肠回路形成的机制提供了见解，并在儿科肠道疾病的背景下开辟了新视角。研究结果扩展了鸡胚模型在肠神经元分化和生理病理相关基因研究中的适用性。
