《Behavioural Brain Research》：Fear conditioning with five footshocks is sufficient to produce stress-enhanced fear learning in rats but does not produce physiological characteristics of stress
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应激增强恐惧学习（Stress-Enhanced Fear Learning, SEFL）被广泛应用于啮齿动物研究中，旨在探究先前的应激经历如何放大随后的恐惧条件作用。大鼠SEFL程序常采用长时间应激暴露（15次非信号化足部电击），且极少观察到性别差异。本研究
应激增强恐惧学习（Stress-Enhanced Fear Learning, SEFL）被广泛应用于啮齿动物研究中，旨在探究先前的应激经历如何放大随后的恐惧条件作用。大鼠SEFL程序常采用长时间应激暴露（15次非信号化足部电击），且极少观察到性别差异。本研究首先探究了5次电击的情境恐惧条件作用程序（非信号化足部电击）如何影响随后的恐惧学习，研究假设在此条件下雌性会对SEFL更为敏感，这基于先前研究显示雌性小鼠在更温和的程序下对SEFL敏感。在后续单一情境-足部电击配对的恐惧条件作用之前，5次不可逃避的足部电击能够显著增强后期的情境冻结反应，且该效应在雄性和雌性中程度相似。进一步的实验表明，即使初始电击由线索信号化，SEFL仍然存在。虽然经历5次非信号化电击后并未增强单次延迟条件作用的冻结反应，但确实增强了对新异线索的反应，这与应激增强恐惧反应（Stress-Enhanced Fear Responding, SEFR）一致。5次和15次电击均增加了即刻早期基因zif268在多个与应激相关脑区的表达，包括前边缘皮层（Prelimbic cortex, PL）、下边缘皮层（Infralimbic cortex, IL）、前部和后部压后皮层（Anterior and posterior retrosplenial cortex, aRSC/pRSC）以及室旁核（Paraventricular nucleus, PVN）。虽然基底外侧杏仁核（Basolateral amygdala, BLA）中zif268表达在5次电击后增加，但15次电击后并未出现此现象。血清皮质酮（Corticosterone, CORT）仅在15次电击后的雌性中选择性升高，而在5次电击后的任一性别中均未升高。这些发现共同表明，经历5次足部电击足以产生SEFL样效应，尽管其并未显示出与15次足部电击应激程序相同的生理学变化。
恐惧条件作用是一种高度适应性的联合学习形式，涉及学习环境因素预测厌恶事件的关系。在正常条件下，条件性恐惧行为与厌恶体验的整体强度成正比，包括足部电击暴露的次数。增加训练期间的足部电击次数通常会产生更强、更持久的恐惧记忆；较少的电击则产生较弱的条件性恐惧反应。然而，先前的应激暴露可以根本改变生物体对较弱厌恶刺激的反应方式，使恐惧学习系统敏感化，以至于通常不足以产生强烈恐惧的条件作用程序能够引发强烈的恐惧反应。应激后对厌恶刺激的反应性增强在神经精神疾病中尤为明显，如创伤后应激障碍（Post-Traumatic Stress Disorder, PTSD），其特征是对轻度厌恶甚至中性刺激的过度反应，以及对新异刺激的恐惧泛化增加。
在啮齿动物研究中，SEFL被用于理解先前的应激经历如何影响随后的恐惧学习。在该任务的一种版本中，大鼠在一个独特环境中暴露于15次强强度（通常为1.0 mA）的足部电击中。随后，大鼠被置于新异环境中，并在该情境中受到单次足部电击。当测试由单次电击配对的情境所诱发的冻结反应时，接受15次不可逃避足部电击的动物比接受等量的无电击应激情境暴露的动物冻结显著更多。电击次数似乎是SEFL易感性的重要决定因素。Van Assche等人的研究表明，增加应激电击次数会增加SEFL易感雄性大鼠的比例。然而，电击次数并未显著影响易感动物的消退学习或恐惧记忆恢复，这表明应激强度主要影响易感性而非SEFL建立后的行为表型。SEFL通常在没有情境恐惧泛化的情况下发生；动物很少在电击前对新异情境表现出增加的冻结，应激组的冻结增加仅在电击传递后才被观察到。
临床研究具有显著的转化相关性，但SEFL中几乎从未观察到性别差异，这限制了SEFL捕捉临床环境中观察到的性别偏向易感性的能力；临床上，女性尤其容易受到应激相关障碍和增强恐惧泛化的影响。然而，啮齿动物SEFL方案通常在雄性和雌性之间产生相当的应激增强恐惧水平，尽管有研究显示在更大的场地中雌性倾向于减少冻结而采用更主动的防御反应。一种可能性是高强度急性应激暴露（15次电击）可能产生天花板效应，掩盖了应激诱导学习上的性别特异性效应。与此解释一致，小鼠中的一些研究表明，使用更温和的"应激"程序时，雌性而非雄性小鼠表现出SEFL。
除电击次数外，这些电击的可预测性也可能进一步影响SEFL结果。不可预测的应激源（如时间、偶联的不可预测性）通常被认为比可预测的应激源更令人厌恶，并引发更强的行为和生理后果，即使整体电击暴露量相等。因此，增加电击可预测性可能降低应激的感知严重性。然而，此类操作是否足以减少SEFL仍不清楚。
本研究首先检验了减少整体应激暴露是否会揭示在强SEFL条件下被掩盖的性别差异，即只有雌性在较轻应激暴露（5次不可逃避足部电击而非15次）后表现出SEFL效应。随后进一步探究了5次电击的应激经历加剧后期恐惧学习的条件。研究评估了在应激阶段或条件作用阶段增加电击传递的可预测性是否改变随后的恐惧表达，假设增加应激源的可预测性会减弱应激增强恐惧学习。还评估了先前的情境条件作用单独是否足以增强后期对新异线索的无条件反应。
在实验方法方面，本研究使用112只年龄匹配（约70天）的雄性和雌性Long Evans大鼠，购自Envigo公司（Indianapolis, IN）。实验采用两套四箱Lafayette Instruments行为箱，修改后作为两种情境。应激阶段使用红色LED照明的黑色背板箱，条件作用和测试阶段使用白色LED照明的白色背板箱。实验3和4中使用 novel context 测试对新异线索的恐惧，该情境配置为平坦金属地板、黑色条纹背板和蓝色LED照明。
实验1中，大鼠接受5次1秒、1.0 mA或0.2 mA的足部电击，刺激间隔5分钟，最后电击后5分钟取出。实验2分为四组：情境+电击组接受5次非信号化电击；情境单独组仅等时暴露；线索+电击组的电击前伴随10秒70 dB白噪声；线索单独组仅接受线索呈现。实验3和4中，应激组接受5次1.0 mA电击，对照组等时暴露。实验5比较5次电击程序与90分钟15次电击经典程序。
行为数据采集使用FreezeFrame软件实时评分冻结反应。数据采用SPSS 31.0进行重复测量方差分析，α设为0.05，使用Fisher's LSD进行后续比较。实验5中，行为结束后90分钟采集血清和脑组织，采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测皮质酮浓度；免疫荧光法检测zif268表达，使用ImageJ软件进行图像分析。
实验1结果：应激阶段，所有动物冻结随时间增加，1.0 mA组更显著；繁殖无差异。训练阶段，先前接受1.0 mA电击的动物和雄性冻结更多。测试阶段，1.0 mA组显著高于0.2 mA组，雌雄均如此，无性别差异。中位分割分析显示，易感动物绝大多数来自1.0 mA组（13/16），而韧性动物多数来自0.2 mA组（13/16）。
实验2结果：应激阶段，接受电击的两组均增加冻结，线索组和情境组无差异。训练阶段，先前电击组在单次电击后无条件冻结更高。情境测试显示，线索+电击组和情境+电击组均比各自无电击对照组冻结更高，且两组间无差异。仅2只情境+电击动物和1只线索+电击动物被归为韧性。
实验3结果：应激阶段与先前一致。训练阶段，两组均在条件刺激（Conditioned Stimulus, CS）-非条件刺激（Unconditioned Stimulus, US）配对后增加冻结，应激组更显著。测试阶段，两组均在CS期比pre-CS期反应增加，但组间无差异。
实验4结果：应激阶段与先前一致。测试阶段，应激组在CS期冻结显著高于无应激组，而无应激组pre-CS与CS期无差异，应激组CS期显著高于pre-CS期。
实验5结果：行为上，15次电击组和5次电击组均增加冻结，但5次电击组最终bin冻结更高。zif268表达方面，PL、IL、aRSC和PVN中，5次和15次电击组均较幼稚对照升高；pRSC中仅15次电击组显著升高，5次电击组为边缘显著趋势；BLA中仅5次电击组升高，与幼稚对照和15次电击组均有差异。皮质酮方面，总体组间差异不显著，但纳入性别后发现显著的组×性别交互作用：15次电击组雌性皮质酮显著高于幼稚对照和5次电击组雌性，且15次电击条件下雌性高于雄性。中位分割显示，15次电击组多数处于"高皮质酮"类别，且该组所有4只雌性均属此类别。
一般讨论指出，五次电击可产生类似SEFL的行为效应，但无典型生理学应激特征。研究首先假设降低应激强度会揭示性别差异，但5次电击在雄性和雌性中产生相当的SEFL，不支持该假设。关于电击可预测性，虽然不可预测应激源通常被认为更令人厌恶，但信号化电击并未减少SEFL样效应，这与某些文献报告不同，可能与电击次数和程序参数有关。
实验3中，先前情境条件作用未增强后续延迟线索条件作用，可能由于对照组本身的CS诱发冻结已较高（约60%），存在天花板效应，而非应激无影响。这与Rau等人使用15次电击和约20%对照冻结率的研究形成对比。
实验4复制并扩展了Nishimura等人在小鼠中的发现，证明5次电击可增强对大鼠新异听觉线索的无条件冻结（SEFR）。这表明5次电击增加的是无条件而非条件性恐惧反应。SEFL通常归因于恐惧敏感化，但也可能更广泛地反映"学习如何学习"的过程，即先前经验促进新关联的形成。Poulos等人证明即使动物对原始电击情境几乎没有冻结，SEFL仍可存在，表明增强的恐惧学习不需要持续的原始恐惧记忆。
5次与15次电击的神经生理学比较显示，两者均激活PL、IL、aRSC和PVN，表明5次电击程序同样 engage 广泛的应激和恐惧相关网络。pRSC中15次电击组激活更强，与该区域的语境记忆处理功能一致。BLA的独特模式——5次电击组升高而15次电击组未升高——可能反映：转录钝化（transcriptional blunting），即长时间强烈应激后的负反馈机制限制即刻早期基因诱导；或组织采集时间点差异，5次电击组在最后电击后1小时处死，而15次电击组立即处死以与第一电击保持时间一致，可能 capture 了BLA动态激活的不同阶段。
皮质酮结果揭示了15次电击特有的性别差异：仅雌性表现出升高。尽管皮质酮合成对SEFL的联合和非联合方面均为必要，但这一内分泌差异未反映在冻结行为上，与标准SEFL范式中性别差异极小或缺失的报告一致。研究表明，性别依赖的分子变化可能在行为结果可比的情况下仍会出现。防御反应如冻结并非单一输出，而是多种竞争防御策略之一。近期研究表明皮质酮可调节竞争防御行为间的平衡，偏向冻结而抑制站立或逃避反应。这提示在3R框架下，未来研究应考虑纳入更多行为测量以全面评估应激诱导适应。
尽管PVN活动在两条件下均升高，但PVN招募本身不足以产生 robust 的系统下丘脑-垂体-肾上腺（Hypothalamic-Pituitary-Adrenal, HPA）轴反应。应激暴露已知可改变后续HPA反应和条件作用期间的神经招募。糖皮质激素可迅速促进突触可塑性并强化编码应激经历的神经连接。因此，性别差异的应激后皮质酮水平可能塑造后续学习过程，即使在测试期间冻结行为无差异。雌性通常表现出更高、更持久的糖皮质激素反应和较弱的负反馈调节，这表明条件性冻结行为不一定反映等效的神经内分泌参与。
研究结论为：5次电击可产生密切 mimic SFL膨的行为反应，即使不产生应激的生理学特征。这些发现支持SEFL样效应可能并非产生生理学应激的程序所特有。文章发表在《Behavioural Brain Research》。
