综述：用于糖胺聚糖代谢的工程化肠道微生物酶：催化机制、多样性及技术应用

《Biotechnology Advances》：Engineering gut microbiota-derived enzymes for glycosaminoglycan metabolism: Catalytic mechanisms, diversity, and technologies

　　贾欢东|崔彦华|曲晓军•总结了参与GAG降解的肠道微生物酶，重点分析了它们的催化机制和底物特异性。•对肠道微生物群中的各种肝素酶、软骨素酶、透明质酸酶以及角蛋白降解酶进行了分类与比较。•研究了硫酸酯酶的亚型（2-O、3-O、4-O和6-O）及其在膳食GAG逐步脱硫酸化过程中的作用。•对具有潜在GAG代谢能力的肠道来源乳酸菌进行了基因分析，并将其候选酶与功能已明确的同类酶进行了对比。•酶工程技术提升了多糖裂解酶和硫酸酯酶的稳定性和催化性能。

引言
糖胺聚糖（GAGs）是由重复的二糖单元构成的线性多阴离子聚合物，通常由一种氨基己糖和一种糖醛酸组成，广泛存在于动物组织中（Hardingham, 2006）。在肠道中，GAGs可能来源于宿主自身或膳食摄入，不过其相对含量和结构类型目前尚不明确。研究表明，小鼠肠道中与GAG相关的PULs表达上调，表明肠道微生物群能够在体内感知并利用与GAG相关的底物（Li et al., 2015）。根据核心二糖单元的不同，GAGs可被分为硫酸软骨素/硫酸皮肤素、透明质酸、肝素/硫酸肝素以及硫酸角蛋白（图1）。除硫酸角蛋白外，其他GAGs还含有己糖胺和糖醛酸。己糖胺可以是N-乙酰己糖胺或N-硫酸化葡萄糖胺，尤其是在硫酸肝素/肝素中（Meneghetti et al., 2015）。值得注意的是，硫酸肝素/硫酸肝素和硫酸软骨素/硫酸皮肤素属于较为复杂的GAGs，它们分别由不同的硫酸化二糖单元构成，包括D-葡萄糖醛酸/艾杜糖酸-N-乙酰-D-葡萄糖胺以及葡萄糖醛酸/艾杜糖酸-N-乙酰-D-半乳糖胺。除了透明质酸和硫酸角蛋白外，GAG的生物合成始于与核心蛋白的丝氨酸残基相连的保守四糖引物的形成（Esko and Zhang, 1996）。GAGs的多样性源于二糖组成的差异、糖醛酸的异构化以及硫酸化模式的不同。在硫酸软骨素和硫酸皮肤素中，硫酸化主要发生在GalNAc的C-4或C-6位点的O-硫酸化，同时还有葡萄糖醛酸或艾杜糖酸的2-O-硫酸化。而硫酸角蛋白则主要以半乳糖和葡萄糖胺残基上的6-O-硫酸化为特征。硫酸肝素和硫酸肝素则表现出最为多样的硫酸化模式，包括己糖胺上的2-O-硫酸化、葡萄糖胺C-2位的N-硫酸化、葡萄糖胺上的6-O-硫酸化，以及较为少见但功能重要的3-O-硫酸化反应（Stopschinski et al., 2018）。

这些GAG修饰赋予了它们化学特异性，使其在胚胎发育、组织形态形成、器官生成、炎症反应以及疾病进展过程中发挥着多种作用（Casale and Crane, 2025）。除了透明质酸外，GAG链通过四糖连接子结合在目标核心蛋白上，进而生成大量存在于细胞表面和细胞外基质中的蛋白聚糖（PGs）（Jinno and Park, 2015）。某些带有硫酸化GAG链的蛋白聚糖可作为人类肠道微生物群的营养来源。体内转座子筛选也表明，碳水化合物利用基因有助于拟杆菌属在肠道中的定植与存活（Goodman et al., 2009; Shmagel et al., 2019）。硫酸软骨素/硫酸皮肤素参与了多种生理和病理过程，包括炎症性肠病、肠道上皮细胞分化以及中枢神经系统中的脑肠轴发育（Francis et al., 2024; Mapstone et al., 2020; Syx and Malfait, 2024）。硫酸肝素/硫酸肝素可与酶抑制剂、趋化因子及生长因子相互作用，从而介导细胞的黏附、分化及炎症反应，而硫酸角蛋白则与细胞增殖及肿瘤形成相关（García-Jiménez et al., 2017; Lin et al., 2017; Funderburgh, 2000）。透明质酸通常根据分子量分为高分子量透明质酸和低分子量透明质酸（Sudha and Rose, 2014; Nam et al., 2023）。高分子量透明质酸的抗血管生成和免疫抑制作用日益受到重视，而低分子量透明质酸则被认为具有促进组织再生的作用，尤其在促进皮肤伤口愈合方面（Huang et al., 2019; Nguyen et al., 2023）。最新研究还表明，这些由分子量决定的功能差异与健康状态及疾病状态下的GAG硫酸化及降解特征密切相关（Francis et al., 2024）。

基于这些与分子量相关的生物活性，多种GAGs及其衍生的寡糖，包括硫酸肝素、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸角蛋白以及合成的硫酸肝素寡糖，已被用作或开发为生物医学制剂（Hemker, 2016; Bukhari et al., 2018; Caterson and Melrose, 2018; Lever and Page, 2002）。需要指出的是，这类药物要在人体内发挥效果，就需要肠道微生物群的参与（Ndeh et al., 2020）。在肠道拟杆菌中，GAGs是通过专门的多糖利用基因座进行代谢的。在这些基因座中，多糖裂解酶的协同降解作用与硫酸酯酶的脱硫酸化作用对于GAG的分解、脱硫酸化以及后续被微生物利用至关重要。碳水化合物活性酶的分析进一步表明，厚壁菌门和放线菌门也编码多糖裂解酶，有些菌株甚至拥有可能与GAG代谢相关的基因簇（Kawai et al., 2018）。这些发现凸显出多糖裂解酶和硫酸酯酶在微生物GAG代谢中的核心地位，它们是实现微生物完全利用GAG的关键。

多糖裂解酶通过β-消除机制切断糖苷键，从而启动GAG的代谢过程，目前已有14个多糖裂解酶家族被确认具有这种功能。尽管其他一些多糖裂解酶家族的酶，尤其是PL34，与已知的GAG裂解酶在序列和结构上存在显著相似性，但目前还没有直接证据表明它们能够切割GAGs（Wei et al., 2024）。最新研究显示，拟杆菌门中的GAG代谢主要与PL8、PL12、PL13、PL15、PL29、PL33和PL37有关（表1）（Hyun et al., 2015; Konasani et al., 2018; Ndeh et al., 2020; Zhang et al., 2021）。相比之下，肠道厚壁菌门和放线菌门则主要依靠PL8和PL12来切割GAGs（Sasisekharan et al., 2006）。根据底物特异性，这些多糖裂解酶还可进一步分为肝素酶、软骨素酶ABC类以及透明质酸酶，这反映了它们在降解不同类型GAG结构中的作用（Sasisekharan et al., 2006）。

硫酸酯酶能够去除生物分子如GAGs上的硫酸基团，从而使肠道微生物群能够彻底降解它们。肠道内的脱硫酸化是获取高硫酸化糖类中的碳源和氮源的关键步骤，而最大的硫酸酯酶家族S1包含111个亚家族，它们具有不同的底物特异性和催化机制（Hanson et al., 2004; Barbeyron et al., 2016）。例如，S1_5和S1_15能作用于6-O-硫酸基团，S1_7可处理硫酸肝素中的2-O-硫酸化艾杜糖酸，而S1_8则能水解葡萄糖胺上的N-硫酸基团。S1_11酶是外切型的6-O-硫酸酯酶，能够作用于硫酸肝素中的6S-葡萄糖胺酸和6S-葡萄糖胺酸硫酸盐残基，而S1_27酶则对硫酸软骨素/硫酸皮肤素中的4-O-硫酸化残基具有区域选择性。S1_4和S1_9进一步展现了参与GAG代谢的硫酸酯酶的功能多样性（Barbeyron et al., 2016; Luis et al., 2022; Luis et al., 2023）。这些发现体现了肠道微生物的酶学多样性，同时也表明有必要对硫酸酯酶进行更精细的分类，以便更好地理解它们在降解硫酸化糖类底物中的作用。

早期的关于GAGs的研究主要集中在其结构特征上，包括二糖组成、硫酸化模式以及与蛋白质的相互作用（Muir, 1969; Hileman et al., 1998）。随着分离纯化技术的不断发展，人们越来越关注GAGs的代谢与合成，以及基于GAG的药物和功能性成分的开发（K?witsch et al., 2018）。此外，酶工程、分子生物学和酶技术也为GAG研究提供了更多工具，为探索肠道微生物群对GAG的代谢机制开辟了新的途径。因此，了解能够代谢GAG的酶对于指导酶工程研发、提高基于GAG的药物的生物利用度及其在体内的作用具有重要意义。然而，以往的研究大多集中在拟杆菌门中的GAG降解酶或个别酶上，而肠道微生物群中其他成员代谢GAG的机制仍缺乏深入研究（Shim and Kim, 2008）。在本综述中，我们系统地分析了调控肠道微生物降解GAGs的酶学机制，重点探讨了多糖裂解酶和硫酸酯酶的结构分类及其功能特点。通过对多糖裂解酶家族和S1硫酸酯酶亚家族的全面系统发育分析，我们发现了它们在底物特异性和催化适应性方面的差异，进一步强调了它们在降解复杂GAG聚合物中的作用。此外，我们还介绍了用于定制制备多糖裂解酶和硫酸酯酶的酶工程进展，阐述了它们目前的应用情况，并探讨了其在治疗领域和生物技术领域的未来前景。

片段摘录
肠道微生物群会代谢GAGs。人类肠道微生物群主要包括拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门、放线菌门、疣微菌门和梭菌门（Ndeh and Gilbert, 2018）。其中，拟杆菌门和厚壁菌门是最为常见的两类（Garg and Mohajeri, 2024）。在新生儿时期，双歧杆菌和乳杆菌在肠道中占主导地位（Ndeh and Gilbert, 2018）。人类肠道微生物群的比例会随年龄、饮食、压力等因素而发生变化。人乳中含有416.2毫克/升的GAGs，其中主要是硫酸软骨素（60–70%）和硫酸肝素……

肠道微生物群中多糖裂解酶降解GAGs的机制
多糖裂解酶是一类通过β-消除反应切断GAG链中β-1,4糖苷键的裂解酶（Ma et al., 2024）。那些已被鉴定并通过生化特性验证的、参与GAG降解的酶被分为13个家族（表1）（Drula et al., 2022）。肠道微生物群，包括拟杆菌门、厚壁菌门和放线菌门，都携带编码糖苷水解酶和多糖裂解酶的基因（Panwar et al., 2023）。最近的研究表明，数千种酶的组合共同作用于糖类的降解……

肠道微生物群中硫酸酯酶降解GAGs的机制
硫酸酯酶能够去除硫酸化生物分子上的硫酸基团，是一类在生物学和工业领域都具有重要意义的酶类（Stam et al., 2023）。根据序列同源性和催化机制，硫酸酯酶可分为四个蛋白家族：甲酰甘氨酸依赖型硫酸酯酶（S1家族）、烷基硫氧还蛋白酶（S2家族），代表酶为假单胞菌S-313产生的烷基硫酸酶AtsK、烷基硫醇水解酶（S3家族），代表酶为某种酶产生的烷基硫酸酶SdsA1……

针对肠道微生物群的酶工程技术
来自肠道微生物群的多糖裂解酶和硫酸酯酶在疾病治疗以及基于糖类的药物生物制造领域展现出巨大潜力（Cioni et al., 2022）。目前，肝素酶、透明质酸酶、硫酸软骨素酶、硫酸角蛋白降解酶以及硫酸酯酶都已通过酶工程技术被成功改造，可用于生产高纯度的寡糖（Ju et al., 2024）。然而，许多来自厌氧肠道微生物的天然多糖裂解酶和硫酸酯酶由于种种原因，尚未能达到这些应用的要求……

结论与未来展望
来自胃肠道的GAGs既是多种肠道微生物群的营养来源，也是其定植的重要因素，而膳食中的GAGs则可为结肠提供额外的腔内GAGs来源。虽然早期研究主要聚焦于拟杆菌门，但最新研究显示，包括厚壁菌门、变形菌门和放线菌门在内的多个菌门也具备利用GAG的酶学途径。这些发现充分体现了肠道微生物群在代谢GAG方面的能力……

伦理声明
本文没有涉及任何作者所进行的包含人类受试者或动物的研究。所有作者均声明不存在利益冲突。所有作者均已阅读并同意发表本稿件。

未引用参考文献
Astó et al., 2019
Gamboa et al., 2018
Hayes and Melrose, 2020
Heinrich et al., 2019
Lan et al., 2023
Lu et al., 2023
Ni et al., 2025
Reisky et al., 2019
Snetkov et al., 2020
Zhang et al., 2025
Zhao et al., 2022
Zheng et al., 2024

利益冲突声明
所有作者均声明不存在利益冲突，也没有任何竞争性财务利益。