《Beverage Plant Research》：Metabolome analysis of processing methods regulating flavor precursors in Arabica coffee beans and correlation with sensory attributes
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为探究不同加工方法（WP，湿法加工；DP，干法加工；AFWP，厌氧发酵湿法加工；AFDP，厌氧发酵干法加工）对生咖啡豆中风味前体的影响，并阐明其与感官风味的相关性，本研究采用基于超高效液相色谱-电喷雾电离-串联质谱（UPLC-ESI-MS/MS）的广泛靶向代谢
为探究不同加工方法（WP，湿法加工；DP，干法加工；AFWP，厌氧发酵湿法加工；AFDP，厌氧发酵干法加工）对生咖啡豆中风味前体的影响，并阐明其与感官风味的相关性，本研究采用基于超高效液相色谱-电喷雾电离-串联质谱（UPLC-ESI-MS/MS）的广泛靶向代谢组学与冲泡咖啡感官评价相结合的系统分析方法。多变量统计分析表明，不同加工方法的非挥发性化合物代谢谱存在显著差异。结果显示，在1,682种非挥发性化合物中筛选出843种差异代谢物，包括氨基酸衍生物、脂质、酚酸和有机酸。厌氧发酵显著提高了代谢物的相对丰度，尤其在AFDP中，代谢物主要集中在氨基酸代谢和核苷酸代谢相关通路中。研究人员采用KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）分析鉴定出45条差异表达通路中的125种特征性代谢物，并将其聚类为四个簇。冲泡咖啡的感官分析表明，厌氧发酵咖啡在干/湿香气、风味、余韵、酸度、醇度和平衡性方面均优于传统加工咖啡。湿法加工咖啡表现出比干法加工咖啡更高的干净度和更低的甜度。通过相关性分析，研究人员鉴定出75种与感官指标显著相关的代谢物，包括D-甘露糖、D-葡萄糖、D-赤藓糖-4-磷酸、芥子酸、L-乳酸、γ-氨基丁酸、咖啡酸和七叶亭等，这些代谢物可视为生咖啡豆中重要的风味前体。上述研究结果为理解不同加工方法处理的阿拉比卡咖啡风味前体及风味特性提供了有价值的理论基础。
咖啡作为全球广泛消费的饮品作物，其风味特征由酸度、甜度和苦度的平衡组合所决定，这一感官特性受到咖啡基因型、栽培管理、采后加工、烘焙及冲泡等多种因素的影响。其中，采后处理是获得适合烘焙的生咖啡豆的关键环节，对咖啡饮料品质具有重要影响。生咖啡豆化学成分复杂，含有超过1,000种具有独特化学性质的不同化合物，其中包括多种重要的风味前体化合物。研究表明，蛋白质和碳水化合物的组成与烘焙咖啡豆中通过美拉德反应（Maillard reaction）形成的风味相关，而酚酸含量则可能影响烘焙咖啡豆的苦味。此外，咖啡还含有咖啡因、绿原酸等多种生物活性物质，对人体感知具有重要的心理刺激作用，且咖啡及其成分的摄入与多种疾病的改善相关。
传统咖啡加工方法主要包括湿法加工和干法加工。湿法加工涉及将去皮后的咖啡樱桃浸泡在水中以去除果胶，随后自然干燥；干法加工则是将咖啡樱桃直接置于自然环境中发酵和干燥。通常，湿法加工处理的咖啡豆具有干净的风味和明亮的果酸，而干法加工处理的咖啡豆则具有更复杂的风味和独特的热带水果风味。随着加工技术的进步，半干法加工、厌氧发酵、酿酒酵母发酵和二氧化碳浸渍等新兴初级加工方法不断涌现，每种方法均赋予咖啡豆独特的风味特征。现有研究多聚焦于这些加工方法对烘焙豆风味品质和生物活性的影响，而对生咖啡豆的分析相对较少。
中国超过98%的咖啡产自云南省，其中"卡蒂姆"（Catimor）品种占阿拉比卡咖啡种植面积的90%以上。随着人民生活水平的不断提高，中国咖啡产业正经历显著增长，咖啡企业和农户不断尝试新兴加工方法以满足日益增长的消费需求，其中厌氧发酵最为常见。为更好地阐明厌氧发酵与传统加工方法之间生咖啡豆的差异，本研究系统分析了四种加工方法的非挥发性化合物和风味前体，旨在探索不同加工方法之间的特征性成分，阐明主要差异化合物的风味特性和生物活性，为咖啡农户选择适宜的初级加工方法提供理论参考。
本研究于2023年3月在中国云南省保山市潞江镇新寨村采集栽培品种"卡蒂姆"的新鲜咖啡樱桃，经筛选去除未成熟、过熟和缺陷果实后，将样品均分为四份，每份10 kg，分别进行湿法加工、干法加工、厌氧发酵湿法加工和厌氧发酵干法加工四种处理。所有样品均分析三个生物学重复。湿法加工采用机械脱壳后水中浸泡12 h去除果胶再自然干燥；干法加工将咖啡樱桃直接置于干燥架上自然干燥；厌氧发酵湿法加工在脱壳后将咖啡樱桃置于密闭塑料袋中抽真空形成完全厌氧环境发酵7 d，再按湿法加工处理；厌氧发酵干法加工则将完整咖啡樱桃密封于塑料袋中厌氧发酵7 d后再进行干法加工。所有咖啡豆统一干燥至水分含量11.0 ± 1.0 g/DW后取样，用咖啡脱壳机去除外壳后收集备用。
研究采用的主要关键技术方法包括：基于UPLC-ESI-QTRAP-MS/MS的广泛靶向代谢组学技术，结合真空冷冻干燥和甲醇水溶液提取的前处理方法；由五名Q-Grader认证的专业咖啡品鉴师按照精品咖啡协会（Specialty Coffee Association, SCA）标准进行的咖啡杯测感官评价；以及包括无监督主成分分析（PCA）、层次聚类分析（HCA）、正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）和Pearson相关性系数（PCC）分析在内的多变量统计分析方法，其中OPLS-DA用于筛选变量重要性投影（VIP）> 1的差异代谢物，KEGG数据库用于代谢通路注释和富集分析。
**代谢谱分析揭示不同加工方法的代谢组特征**
四种加工方法的代谢组分析共鉴定出1,706种化合物，分属12个主要类别。其中氨基酸及衍生物数量最多（383种，22.45%），其次为酚酸（256种，15.01%）、其他类（212种，12.43%）、脂质（184种，10.79%）、生物碱（161种，9.44%）和黄酮类（119种，6.98%）等。总体而言，四种方法的代谢谱存在差异。AFDP在氨基酸及衍生物、核苷酸及衍生物、有机酸、黄酮类和单宁类中的代谢丰度最高。厌氧发酵咖啡豆（AFWP和AFDP）中脂质和生物碱的代谢丰度显著高于非厌氧发酵样品（WP和DP）。主成分分析中PC1和PC2分别解释了51.29%和14.41%的变异，同一加工方法的生物学重复聚为一组，表明取样可靠。Pearson相关性分析显示，相同样品重复之间的相关性较高，而AFDP与WP（0.45-0.49）、AFDP与DP（0.51-0.56）之间的相关性最低，表明这些加工方法在代谢组上差异较大。
**差异代谢物筛选与比较分析**
为阐明不同加工方法生咖啡豆中代谢物的显著差异，研究人员基于VIP > 1、FDR < 0.05和log2|FC| > 1的条件筛选差异代谢物。WP vs DP组共鉴定出80种差异代谢物（63种上调，17种下调），主要涉及氨基酸及衍生物、有机酸和糖类。AFWP vs AFDP组鉴定出460种差异代谢物（384种上调，76种下调），包括210种氨基酸及衍生物、48种黄酮类、45种酚酸、35种脂质和29种生物碱，表明厌氧发酵后无论湿法还是干法处理均比传统处理产生更多差异代谢物。其中变化倍数最大的前10种化合物全部在AFDP中丰度更高，包括5种黄酮类、2种生物碱、2种单宁和1种有机酸。WP vs AFWP组鉴定出449种差异代谢物，其中424种在AFWP中丰度更高。DP vs AFDP组673种代谢物差异积累，564种在AFDP中丰度增加。这些结果表明厌氧加工比传统方法提高了代谢物水平。四类比较组共鉴定出843种差异代谢物，包括279种氨基酸及衍生物、116种酚酸、101种脂质、60种黄酮类、58种生物碱等。Venn图分析显示14种代谢物在不同加工方法间均存在显著差异，可能作为区分不同加工方法的潜在生物标志物。从峰面积来看，无论是否经厌氧处理，干法加工的代谢物丰度均高于湿法加工；厌氧发酵后绿咖啡豆中代谢物的相对含量显著增加。
**KEGG通路富集分析揭示关键代谢变化**
为阐明不同加工方法间差异代谢物显著富集的生物学通路，研究人员进行了KEGG富集分析。WP vs DP组显著富集6条通路，代表性通路包括磷酸转移酶系统、戊糖磷酸途径、精氨酸和脯氨酸代谢、果糖和甘露糖代谢以及半乳糖代谢。AFWP vs AFDP组显著富集9条通路，包括黄酮类生物合成、花青素生物合成、叶酸生物合成、核苷酸代谢以及黄酮和黄酮醇生物合成。WP vs AFWP组显著富集17条通路，代表性通路包括GABA能突触、植物激素生物合成、芳香族化合物降解、cAMP信号通路以及乙醛酸和二羧酸代谢。DP vs AFDP组显著富集13条通路，包括嘌呤代谢、核苷酸代谢、丙酸代谢、苯丙素生物合成以及氨基苯甲酸降解。
**特征代谢物的聚类分析与感官评价关联**
通过KEGG通路分析，四组比较共鉴定出45条显著差异表达代谢通路，涵盖125种差异代谢物的变化。层次聚类分析将这些代谢物分为四个簇。簇1包含17种差异代谢物，主要特征为厌氧发酵前后存在差异（AFWP和AFDP的代谢丰度显著高于WP和DP），包括5种有机酸、4种酚酸、4种糖类、3种生物碱和1种核苷酸及衍生物。簇2包含11种差异代谢物，其中几乎所有代谢物在DP中表达丰度更高，包括肉桂酸、阿魏酸、芥子酸等重要有机酸。簇3包含数量最多的差异代谢物，主要由17种核苷酸及衍生物、14种黄酮类、13种氨基酸及衍生物、13种酚酸、10种有机酸和10种糖类等组成，该簇中88种差异代谢物在AFDP中均显著高表达，涉及核苷酸代谢、苯丙素生物合成和黄酮类降解等与风味形成和生物活性相关的多条通路，表明厌氧条件通常对代谢物水平有积极影响，尤其在干法中效果更显著。簇4中丰度最高的主要在WP组，主要包括与磷酸转移酶系统相关的核苷酸及衍生物，如腺苷5'-二磷酸、2'-脱氧肌苷-5'-单磷酸、肌苷5'-单磷酸和腺苷5'-单磷酸。
杯测感官分析表明，厌氧发酵咖啡（AFWP和AFDP）在干/湿香气、风味、余韵、酸度、醇度和平衡性方面均优于传统加工咖啡（WP和DP）。根据观察到的生物活性和非挥发性化合物，厌氧发酵样品的所有化合物组浓度均更高，这可能是上述属性得分较高的原因。然而，无论是否采用厌氧发酵，湿法加工咖啡均表现出比干法加工咖啡更高的干净度和更低的甜度。
**感官指标与特征代谢物的相关性分析**
为消除数量对模式识别的影响，研究人员对125种差异代谢物的峰面积进行log2转换，随后与感官指标进行Pearson相关性分析（r2 > 0.9，p < 0.05）。分析显示几乎所有差异代谢物均与感官指标呈正相关。网络中38种特征代谢物仅与单一感官指标相关，其中与醇度相关的特征代谢物最多（23种），主要包括8种氨基酸衍生物和8种核苷酸及衍生物。与酸度显著相关的化合物包括5种有机酸（琥珀酸、甲基丙二酸、5-氨基戊酸、茉莉酸和苯丙酮酸）和3种糖类（肌醇、D-甘露醇和D-山梨醇）。甜度仅与3种糖类显著正相关，即D-甘露糖、D-葡萄糖和D-赤藓糖-4-磷酸；干净度则仅与1种酚酸——芥子酸显著负相关。一些特征代谢物与多种感官指标相关，如核苷酸衍生物腺苷5'-单磷酸和2'-脱氧鸟苷均与风味、余韵、醇度和平衡性显著正相关。L-乳酸与余韵、酸度和平衡性显著正相关；γ-氨基丁酸和咖啡酸与酸度和平衡性呈显著正相关；七叶亭与醇度和平衡性显著正相关。
**讨论部分总结与研究结论**
研究人员在讨论中指出，咖啡加工方法可显著影响感官质量和用户偏好。传统加工方法中，湿法加工的发酵步骤在去皮后于水中浸泡以加速果胶去除，干法加工则直接暴露种子于阳光或空气干燥器中进行自然发酵。新兴加工方法如二氧化碳浸渍、消化处理和厌氧处理等通过改良发酵过程来优化感官特性。本研究聚焦于比较传统与厌氧条件下湿法和干法加工的代谢谱和风味差异，以阐明生咖啡豆中风味前体化合物对不同加工方法感官指标的影响。
早期研究已表明湿法和干法加工在物理和感官品质参数、氨基酸谱、果糖和葡萄糖水平以及生物活性氨基酸方面存在大规模差异。本研究中DP与WP的比较代谢组学进一步揭示，属于生物碱、氨基酸及衍生物、有机酸、糖类以及核苷酸及衍生物等多种化合物类别的代谢物在DP中含量更高。与湿法加工相比，干法加工允许进一步的代谢，从而提供更高的糖水平。尽管早期研究排除了WP中糖被浸出的可能性，并指出代谢变化是主要过程，但部分代谢组在水中溶解的可能性仍不能完全排除。DP已被证明更有益，产生比WP和二氧化碳浸渍更高水平的生物活性物质，但这不能推广到所有代谢化合物类别，因为不同物质受水或日晒干燥的影响不同。在本研究所述条件下，"卡蒂姆"咖啡的干法加工应优先于湿法加工。
在新兴加工方法中，厌氧发酵使咖啡在缺氧条件下加工。近期研究表明其具有改善感官特征、创造酒香、木香和草本香等优势，这些变化归因于生物群落多样性变化、微生物代谢和消化性能以及咖啡豆代谢三种机制。本研究结果与这些机制相关，明确显示这些加工方法提供更大的代谢物多样性。AFWP和AFDP均表现出比DP和WP显著更高数量的差异代谢物及其相应水平，表明厌氧加工提供更大的代谢物多样性。从代谢组组成角度来看，厌氧发酵方法（AFWP和AFDP）比WP和DP分别提供更好的谱图。因此，在所研究条件下，AFDP方法应为中国云南"卡蒂姆"品种阿拉比卡咖啡的首选加工方法。
在通路水平，氨基酸及衍生物的大规模变化已被观察到。氨基酸和碳水化合物均为厌氧生物的已知能量和生长来源。特别是与WP和DP相比，AFWP和AFDP中L-谷氨酸的减少与谷氨酸被厌氧菌发酵的事实一致。除氨基酸生物合成外，糖酵解/糖异生、戊糖磷酸途径、丙酸途径和柠檬酸循环等主要差异变化也被注意到。AFDP中乳酸含量的增加表明其在厌氧条件下产生增强，有助于抑制病原微生物生长同时促进酵母生长。AFDP中D-葡萄糖酸含量降低和乳酸增加表明可能存在乳酸菌，这需要在未来的研究中验证。厌氧发酵还影响除氨基酸外其他代谢物如黄酮类和萜类的含量和组成，这些变化与其他植物和咖啡中的已知趋势一致。
对于咖啡等饮料，杯测或许是确定其感官品质的最终测试，尽管感官分析存在局限性和主观性。本研究中，厌氧发酵咖啡在干/湿香气、风味、余韵、酸度、醇度和平衡性方面整体优于传统加工咖啡，这与样品的代谢谱一致。通过相关性分析，研究人员鉴定出多种与感官属性相关的关键风味前体。例如，8种氨基酸及衍生物和8种核苷酸及衍生物与醇度显著相关，这些氨基酸中的大多数具有挥发性，是烘焙后的强嗅觉化合物，其中L-蛋氨酸产生麦芽味和果味，L-亮氨酸和L-异亮氨酸显著减少咖啡中的苦味化合物。核苷酸如胞嘧啶和鸟嘌呤可能通过烘焙过程影响最终风味谱。γ-氨基丁酸和咖啡酸与酸度和平衡性显著正相关。γ-氨基丁酸是植物中天然存在的具有多种生理功能的生物活性化合物，对人体具有多种健康益处，特别是作为中枢神经系统的主要抑制性神经递质。咖啡酸则是咖啡中重要的酚类化合物。
**研究结论**
本研究比较了传统和厌氧条件下湿法和干法加工对"卡蒂姆"品种阿拉比卡咖啡的影响。结果揭示了不同加工方法在代谢物组成和丰度方面存在显著差异。优势化合物类别为氨基酸及衍生物，其次为脂质、酚酸和有机酸。总体而言，厌氧发酵显著提高了绿咖啡豆的代谢丰度（尤其在AFDP中），主要集中在氨基酸代谢和核苷酸代谢相关通路。Q级认证小组进行的冲泡咖啡感官分析表明，厌氧发酵在干/湿香气、风味、余韵、酸度、醇度和平衡性方面优于传统加工咖啡。湿法加工咖啡表现出比干法加工咖啡更高的干净度和更低的甜度。此外，通过显著通路筛选鉴定的125种特征差异代谢物被分为四个聚类，各聚类表现出不同的代谢谱。经相关性分析，75种代谢物被鉴定为与感官指标显著相关，是生咖啡豆中重要的风味前体。综上所述，结合厌氧发酵条件的干法加工是"卡蒂姆"品种最适宜的处理方法。未来研究应聚焦于鉴定厌氧菌种类及其在咖啡豆发酵中的作用，确定最适发酵持续时间，为选择最佳营养和风味条件提供依据。
