原花青素B2(Procyanidin B2)通过Tmigd1/NF-κB/NLRP3信号轴缓解三苯基磷酸酯(Triphenyl Phosphate, TPHP)诱导的结肠损伤

《Ecosystem Services》：Procyanidin B2 alleviates triphenyl phosphate-induced colon injury through Tmigd1/NF-κB/NLRP3 signal axis

　　

原花青素B2(Procyanidin B2, PCB2)是一种具有抗炎和抗氧化特性的天然膳食多酚，在减轻化学诱导毒性方面显示出潜力。本研究旨在探讨三苯基磷酸酯(triphenyl phosphate, TPHP)诱导结肠损伤的机制及PCB2的保护作用。在小鼠模型中，TPHP暴露引起结肠缩短、屏障破坏、炎症及氧化应激，而PCB2可剂量依赖性逆转上述改变。RNA测序(RNA-seq)分析确定NF-κB信号通路为关键通路，并突出Tmigd1为核心差异基因。TPHP下调结肠中Tmigd1表达，而PCB2可直接结合并上调Tmigd1表达。进一步研究证实，PCB2通过上调Tmigd1抑制NF-κB通路磷酸化及NLRP3(NOD-like receptor family pyrin domain containing 3)炎症小体激活，从而减少促炎细胞因子产生。沉默Tmigd1可消除PCB2的保护效应。采用Caco-2及NCM460细胞进行的体外研究验证了上述关于凋亡、氧化应激及屏障功能的发现。综上，TPHP通过下调Tmigd1并激活NF-κB/NLRP3轴诱导结肠损伤，而PCB2通过靶向Tmigd1抑制该炎性信号发挥保护作用。本研究揭示了TPHP毒性的新机制，并支持PCB2作为环境化学物相关肠道损伤的潜在干预手段。

研究背景与目的

有机磷酸酯(organophosphate esters, OPEs)如三苯基磷酸酯(triphenyl phosphate, TPHP)广泛用作阻燃剂和增塑剂，因其添加性质持续释放至环境中，成为空气、尘埃、水及土壤中的普遍污染物，可通过摄入、吸入及皮肤接触进入人体。已有流行病学及动物实验表明TPHP可致肝、心脏、神经及生殖系统损害，并可诱导肠道炎症、菌群紊乱及屏障受损，但其分子机制尚不清楚，亦无有效干预策略。原花青素B2(Procyanidin B2, PCB2)是存在于葡萄籽和苹果中的天然膳食多酚，具抗炎、抗氧化及上调紧密连接蛋白、抑制NF-κB/NLRP3轴保护肠屏障的作用。鉴于TPHP致肠损伤与PCB2已知保护效应病理特征相似，研究人员假设PCB2通过调控NF-κB/NLRP3炎性信号轴拮抗TPHP诱导的结肠损伤，并进一步探究其是否通过特定靶点Tmigd1(transmembrane and immunoglobulin domain containing 1)发挥作用。

主要关键技术方法

研究采用雄性C57BL/6J小鼠（n=8/组，共5组：对照、TPHP 10 mg/kg灌胃、TPHP+低剂量PCB2 2 mg/kg腹腔注射、TPHP+高剂量PCB2 20 mg/kg腹腔注射、TPHP+5-氨基水杨酸5-ASA 150 mg/kg灌胃）建立TPHP染毒及PCB2干预模型，干预28天；取结肠组织进行苏木精-伊红(hematoxylin and eosin, H&E)染色、阿利新蓝-过碘酸雪夫(Alcian Blue-Periodic Acid Schiff, AB-PAS)染色、免疫组化(immunohistochemistry, IHC)、蛋白质免疫印迹(Western blot)、酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)及氧化应激指标检测；通过FITC-葡聚糖(FITC-dextran)灌胃评估肠道通透性。采用人结肠癌细胞Caco-2及正常人结肠上皮细胞NCM460建立体外TPHP损伤及PCB2预处理模型，进行CCK-8细胞活力、Annexin V-FITC/PI凋亡、活性氧(reactive oxygen species, ROS)DCFH-DA、JC-1线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential, MMP)、免疫荧光(immunofluorescence, IF)及Western blot检测。对结肠组织行RNA测序(RNA-seq)及生物信息学分析，筛选差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)并行GO/KEGG富集及基因集富集分析(gene set enrichment analysis, GSEA)。通过分子对接(molecular docking)、100 ns分子动力学模拟(molecular dynamics simulations, MD)及细胞热位移分析(cellular thermal shift assay, CETSA)验证PCB2与Tmigd1的结合。采用siRNA敲低Tmigd1验证其功能必要性。所有数据以均值±标准差(SD)表示，采用t检验或单因素方差分析(one-way ANOVA)进行统计学分析。

研究结果

3.1. Procyanidin B2 ameliorated TPHP-induced colon injury in mice

通过对各处理组小鼠体重、结肠长度、H&E病理染色、凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2及血清炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的检测，研究人员发现TPHP致体重增长受抑、结肠缩短、黏膜水肿、杯状细胞减少、炎性浸润、Bax上调/Bcl-2下调及血清炎性因子升高；PCB2剂量依赖性恢复体重增长趋势、恢复正常结肠长度、改善病理结构、逆转Bax/Bcl-2比值并降低血清炎性因子，高剂量PCB2(20 mg/kg)效果与阳性药5-ASA相当，表明PCB2可缓解TPHP诱导的小鼠结肠损伤。

3.2. Procyanidin B2 restored intestinal barrier function impaired by TPHP

通过AB-PAS染色、IHC及Western blot检测黏蛋白Muc2及紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1，结合FITC-dextran肠道通透性检测，研究人员发现TPHP致杯状细胞减少、Muc2及紧密连接蛋白下调、通透性增加；PCB2恢复杯状细胞数目、上调Muc2及紧密连接蛋白表达、降低FITC-dextran血浆浓度，表明PCB2通过修复黏液屏障、上调紧密连接蛋白及降低通透性恢复TPHP受损的肠屏障功能。

3.3. RNA sequencing predicted potential targets of PCB2

对对照组、TPHP组及高剂量PCB2组结肠组织行RNA-seq，主成分分析(principal component analysis, PCA)显示组间分离良好；筛选DEGs发现PCB2逆转部分TPHP异常基因。GO富集涉及胃肠上皮维持、IL-1β产生调节等，KEGG富集显示NF-κB(mmu04064)及NOD样受体(NOD-like receptor, NLRP3相关 mmu04621)信号通路显著激活且被PCB2逆转。Tmigd1因被TPHP抑制而被PCB2回补、参与肠上皮完整性维持及潜在调控NF-κB，被选为核心候选靶基因。

3.4. Investigation of PCB2 and its potential target Tmigd1

分子对接显示PCB2与Tmigd1结合能?7.2 kcal/mol，提示强亲和力；100 ns MD模拟RMSD约60 ns后平衡(~2.5 ?)、RMSF<2.3 ?、Rg波动小、SASA无明显变化、平均形成2–3个氢键、吉布斯自由能景观呈单一密集区，表明复合物稳定；CETSA显示PCB2使Tmigd1熔解温度(T_m)右移约4.8℃，证明PCB2与Tmigd1存在直接、稳定的结合相互作用。

3.5. PCB2 alleviated TPHP-induced inflammatory response and oxidative stress via Tmigd1

Western blot及IHC证实TPHP下调结肠Tmigd1蛋白，PCB2剂量依赖性上调。TPHP激活NF-κB(p-NF-κB p65, p-IκBα)、NLRP3炎症小体(NLRP3, ASC, Cleaved-Caspase-1)及下游iNOS、COX-2、IL-1β，并致抗氧化酶(GSH-Px, T-SOD, CAT)活性下降、丙二醛(malondialdehyde, MDA)升高；PCB2剂量依赖性抑制NF-κB/NLRP3轴蛋白表达及下游炎性介质，恢复抗氧化酶活性并降低MDA，表明PCB2通过上调Tmigd1协调抑制NF-κB/NLRP3炎性轴并减轻氧化应激。

3.6. PCB2 alleviated TPHP-induced apoptosis and oxidative stress in Caco-2 and NCM460 cells

CCK-8确定TPHP造模浓度为200 μM(存活~75%)，PCB2(0.2, 1, 5 μM)预处理。研究人员发现TPHP致Bax上调/Bcl-2下调、凋亡率升高、ROS升高、线粒体膜电位下降、抗氧化酶活性降低及MDA升高；PCB2预处理剂量依赖性逆转上述改变，表明PCB2通过抑制凋亡、保护线粒体功能及减轻氧化应激在细胞水平拮抗TPHP损伤。

3.7. PCB2 alleviated TPHP-induced intestinal barrier damage and inflammation in Caco-2 and NCM460 cells

免疫荧光显示TPHP破坏ZO-1及Occludin膜连续性及荧光强度，下调Tmigd1、紧密连接蛋白及上调p-IκBα、p-NF-κB p65、NLRP3相关蛋白及培养上清IL-1β、IL-6、TNF-α；PCB2剂量依赖性恢复紧密连接蛋白膜分布及表达、抑制NF-κB/NLRP3轴及炎性因子。siRNA敲低Tmigd1后，TPHP组炎性蛋白进一步升高，且PCB2无法再抑制其表达，证实Tmigd1是PCB2抗TPHP炎症效应的关键依赖靶点。

讨论与结论总结

讨论部分指出本研究首次阐明TPHP通过下调肠上皮特异性跨膜蛋白Tmigd1使NF-κB/NLRP3炎症轴过度激活致结肠炎症、氧化应激及屏障破坏；PCB2可直接结合并上调Tmigd1，抑制NF-κB p65核转位（推测Tmigd1可能通过其胞内免疫球蛋白结构域结合IκBα阻止其磷酸化降解）进而阻断NLRP3炎症小体组装，发挥保护效应；研究使用临床一线药5-ASA作阳性对照佐证可靠性，并指出局限为仅用雄性小鼠及未探讨肠道菌群代谢PCB2的作用，为后续研究方向。作者自述局限性包括仅使用雄性小鼠及未探讨肠道菌群对PCB2代谢的影响。

结论部分翻译如下：

综上所述，本研究证实环境污染物TPHP可下调Tmigd1，导致NF-κB/NLRP3炎性信号轴过度激活，从而引起结肠炎症、氧化应激及屏障损伤。原花青素B2(Procyanidin B2, PCB2)可直接结合并上调Tmigd1，进而抑制该炎性通路，改善氧化应激水平及肠屏障功能，发挥结肠保护作用。