从扁桃仁蛋白中分离出新型神经保护肽及其对HT22细胞凋亡的调节作用

《Food Bioscience》：Identification of Novel Neuroprotective Peptides from Almond (Amygdalus communis L.) Protein and Their Modulation of Apoptosis in HT22 Cells

　　陆志强|高延松|魏美琪|丁圣杰|刘荣阳|邓星星|林松毅|孔凌明
中国新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市830002，新疆农业大学食品科学与药学院

摘要
氧化应激和胆碱能功能障碍与神经元损伤及认知障碍密切相关，但来自杏仁蛋白的具有特定序列的神经保护肽仍缺乏充分研究。本研究旨在筛选出对东莨菪碱诱导的HT22细胞损伤具有保护作用的杏仁来源肽，并阐明其潜在作用机制。通过碱性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶对杏仁蛋白进行水解，结果发现碱性蛋白酶水解产物表现最佳，其抗氧化相关氨基酸含量为1.120毫克/克，神经保护相关氨基酸含量为0.607毫克/克。在东莨菪碱损伤的HT22细胞中，碱性蛋白酶水解产物具有最强的保护作用，能使超氧化物歧化酶活性恢复到106.12单位/毫克蛋白，同时缓解东莨菪碱导致的谷胱甘肽、乙酰胆碱、脑源性神经营养因子和神经生长因子的减少，以及乙酰胆碱酯酶活性的升高。通过肽组学分析结合PeptideRanker、ToxinPred、分子对接以及100纳秒分子动力学模拟，进一步确定FDPF和FFAP为具有潜力的乙酰胆碱酯酶结合候选肽。合成肽验证表明，这两种肽均能减少东莨菪碱处理过的HT22细胞内的活性氧积累，改善胆碱能指标，并抑制细胞凋亡，其中FFAP的整体保护作用更为显著。与以往主要关注杏仁水解物抗氧化活性的研究不同，本研究采用了一种整合的序列级策略，将酶解、计算机筛选和细胞功能验证相结合。这些研究结果为杏仁来源肽，尤其是FFAP，作为针对氧化应激和胆碱能功能障碍的食品级神经保护成分的应用提供了依据。

引言
随着生活水平的提高，高能量饮食和不健康的生活方式导致慢性亚健康状况的患病率上升，包括代谢紊乱、心血管风险以及认知功能下降（Wu等人，2021）。记忆障碍及相关症状，如学习能力下降和执行功能障碍，日益普遍，给社会带来了越来越大的负担。氧化应激被公认为是认知功能下降的重要诱因，因为过量的活性氧会破坏氧化还原平衡，损害神经元大分子结构，并引发与细胞凋亡相关的神经元损伤（Bai, Guo, Ye, Xie, & Xie, 2022）。此外，胆碱能系统功能失调也是认知功能下降的典型特征，乙酰胆碱与乙酰胆碱酯酶之间的平衡失调会削弱突触传递，加速记忆功能衰退。因此，乙酰胆碱酯酶不仅是重要的治疗靶点，也被视为与阿尔茨海默病病理相关的多功能节点（Chen, Huang, Yang, & Hong, 2022; Grabowska等人，2025）。值得注意的是，氧化应激与胆碱能功能障碍往往相互关联：东莨菪碱对毒蕈碱受体的阻断不仅会导致胆碱能功能障碍，还会加剧神经元模型中的氧化应激和细胞凋亡现象（Zhang等人，2023a）。因此，利用食品资源开发安全有效的策略来抑制与氧化应激和胆碱能功能异常相关的神经元损伤，越来越受到重视。

蛋白质衍生的生物活性肽因其营养价值、序列依赖性活性以及潜在的生物学效应，作为功能性食品成分和神经保护候选物而备受关注。这些肽可通过酶解、微生物发酵、胃肠道消化或食品加工从食物蛋白中释放出来。它们的活性通常与特定的氨基酸序列、疏水/芳香族残基以及具有氧化还原活性的残基有关，这些残基有助于清除自由基、保护细胞以及与生物靶标相互作用（Zhao, Dong, Ge, Cui, Sun, & Lin, 2021）。除了直接的化学抗氧化作用外，许多食品肽还能通过增强内源性防御系统并稳定生存信号传导来发挥作用，这在以东莨菪碱为模型的研究中尤为重要，因为在这些模型中，胆碱能功能紊乱常常伴随氧化应激加剧和细胞凋亡损伤（Lu, Gao, Bao, & Lin, 2024a）。此外，食品来源的肽还可能通过影响神经递质平衡、提升神经营养因子水平以及激活与突触可塑性相关的通路，从而对记忆功能起到调节作用（Wang, Sun-Waterhouse, Neil Waterhouse, Zheng, Su, & Zhao, 2021）。

最近的研究表明，来自不同食物来源的生物活性肽和蛋白质水解物具有广阔的开发潜力。例如，通过液相色谱-质谱联用、计算机预测以及合成肽验证，红藻蛋白已被视为生物活性肽的前体，这体现了整合肽类发现策略的价值（Basri, Mat Amin, & Ahmad, 2025）。益生菌培养物也被证明会影响酸奶中的蛋白水解、生物活性成分及功能特性，这说明食品加工和发酵过程能够影响生物活性肽的产生和质量（Iqbal等人，2025）。此外，来自不同来源的水解胶原蛋白因其抗氧化、降压、抗冻等生物活性，以及在功能性食品、生物医学产品和化妆品中的应用而备受关注（Shaik等人，2025）。这些研究都表明，蛋白质水解物是功能性肽的重要来源。然而，由于水解物中含有复杂的肽混合物，且仅靠化学抗氧化能力无法完全解释细胞的神经保护作用或相关机制，因此寻找特定的神经保护肽仍然具有挑战性。

在植物来源的蛋白质资源中，坚果因其较高的营养价值以及丰富的生物活性成分而尤为值得关注。已有研究表明，核桃衍生的肽可通过减轻氧化应激、调节神经炎症、调控自噬、调节肠道菌群以及维持胆碱能系统平衡等机制发挥神经保护作用（Zhang, Bai, Hong, Xie, & Tian, 2023）。杏仁也是一种富含优质蛋白质、不饱和脂质、矿物质及植物化学物质的营养丰富植物资源，因此杏仁蛋白是制备生物活性肽的理想底物。先前的研究已表明，杏仁蛋白衍生的组分能够调节活化巨噬细胞中的炎症介质（Udenigwe, Je, Cho, & Yada, 2013），而近期对杏仁副产品的加工/水解研究也证实，酶解处理能够产生具有显著抗氧化特性的富含肽的物质（de Souza, Dias, Oliveira, de Moura Bell, & Koblitz, 2020; Sari等人，2024）。不过，与核桃衍生的神经保护肽及其他已被深入研究的食品肽相比，将杏仁蛋白肽与神经元细胞中的氧化应激、胆碱能功能障碍、神经营养因子恢复及细胞凋亡联系起来的系统性证据仍然较少。

因此，本研究的创新之处在于通过整合化学分析、细胞实验和计算机模拟策略，从序列层面识别并验证了杏仁衍生的神经保护肽。通过不同蛋白酶对杏仁蛋白进行水解，获得低分子量肽段，再根据抗氧化能力和在东莨菪碱损伤的HT22细胞中的保护效果选出最活跃的肽段。随后通过肽组学分析、生物信息学筛选、针对乙酰胆碱酯酶的分子对接、分子动力学模拟以及合成肽验证，进一步确定了具有代表性的活性肽序列。本研究旨在明确杏仁衍生气肽在对抗氧化应激和胆碱能功能障碍方面的神经保护潜力，为其作为食品级功能性成分的开发提供理论依据。

材料
本研究以脱脂杏仁（Amygdalus communis L.）仁为原料，该原料购自伊宁神兰科技有限公司。用于水解的蛋白酶，包括碱性蛋白酶（编号S10154）、中性蛋白酶（编号S10013）和胰蛋白酶（编号S23119），均购自上海源恩生物技术有限公司。MTT试剂（编号IM02808）购自Solarbio Science & Technology Co., Ltd.。用于检测脑源性神经营养因子的初级抗体（兔源mAb；编号A4873）及神经...

杏仁蛋白肽的制备与水解行为
为获得用于后续活性筛选的低分子量肽库，本研究使用碱性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶对杏仁蛋白进行水解。当水解时间从1.5小时延长至3.5小时时，水解程度显著增加（图1A），这说明肽键逐渐断裂，游离α-氨基团不断释放。在这三种酶中，碱性蛋白酶在两个时间点下的水解程度均最高，表明其具有更强的水解能力...

结论
本研究采用酶解、抗氧化评估、肽组学分析、分子对接、分子动力学模拟以及细胞实验相结合的整合策略，对杏仁衍生的神经保护肽进行了研究。结果显示，碱性蛋白酶水解产物具有最强的抗氧化能力、最理想的氨基酸组成，并且能够通过增强SOD/GSH抗氧化防御系统、调节...

作者贡献说明
陆志强：撰写原始稿件、数据可视化、验证、方法设计、实验研究、资金获取、数据整理、概念构思。高延松：实验研究、数据整理。魏美琪：实验研究、数据整理。丁圣杰：数据整理。刘荣阳：数据整理。邓星星：方法设计、实验研究。林松毅：监督指导、概念构思。孔凌明：监督指导、项目管理、资金获取、概念构思。

未引用参考文献
Liu等人，2009；Zhang等人，2023。

利益冲突声明
作者声明，就本文所述研究内容而言，不存在任何利益冲突。

数据可用性
数据可应要求提供。

生成式AI使用声明
我们未使用生成式AI或AI辅助技术来创建或修改任何图表或实验数据；若使用了AI工具，也仅在所有作者的监督下用于语言润色，且作者对内容负全责。

利益冲突声明
作者声明，他们没有已知的可能影响本文所述研究的财务利益或个人关系。

致谢
本研究得到了新疆维吾尔自治区自然科学基金（2025D01B57）、新疆维吾尔自治区教育厅天池青年学者计划以及新疆维吾尔自治区重点研发计划项目（2024B04015）的支持。同时，感谢“Home for Researchers”编辑团队（www.home-for-researchers.com）提供的图表支持。