《International Journal of Biological Macromolecules》：Computationally guided cross-linking overcomes interfacial mismatch in protein dimerization: Creating a long-acting cocaine esterase
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Xingyu Deng|Zhiguo Wang|Yuxin Hou|Nuo Xu|Zhenzhen Li|Qi Hu|Nan Mo|Ziying Ren|Cong Chen|Shurong Hou|Xiabin Chen|Lei Ma•利用BMOE的分子动力学引导拓扑匹配策略可稳
Xingyu Deng|Zhiguo Wang|Yuxin Hou|Nuo Xu|Zhenzhen Li|Qi Hu|Nan Mo|Ziying Ren|Cong Chen|Shurong Hou|Xiabin Chen|Lei Ma
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利用BMOE的分子动力学引导拓扑匹配策略可稳定CocE二聚体。
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在C196/C301位点进行特异性交联可生成均匀的CocE-HD结构。
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CocE-HD的稳定性得到提升（熔点升高10℃，半衰期延长3.6倍）。
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在大鼠体内，CocE-HD可在给药后2小时内保持快速清除可卡因的能力。
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这是一种可用于稳定治疗用蛋白候选物的通用策略。
引言
蛋白质的结构稳定性是其发挥治疗作用的基础，而热稳定性和体内半衰期则是决定其能否成功用于临床的关键因素。然而，蛋白质药物复杂的立体构象很容易受到温度和pH值等生理因素的影响而发生改变，从而导致其活性丧失或聚集[1]。随着温度上升，热量会促使蛋白质构象的振动和移动加剧，进而影响酶的功能。为了解决这一问题，可以在分子内部或单体界面引入二硫键形成二聚体，从而增强蛋白质内部的相互作用，提高构象的刚性，进而抑制不利的构象变化[2]、[3]、[4]、[5]。这一方法在多种蛋白质中都取得了成功，包括转谷氨酰胺酶、三磷酸异构酶，以及枯草杆菌蛋白酶、T4溶菌酶和二氢叶酸还原酶[6]、[7]、[8]、[9]、[10]。尽管取得了这些成果，但蛋白质工程仍面临一个重大挑战：有效的二硫键形成需要极其严格的几何参数，包括特定的键角以及约2.0埃的精确硫原子间距[11]。这些严格的要求往往与蛋白质界面固有的动态特性和构象灵活性相冲突。因此，仅基于静态结构数据设计的二硫键在灵活环境中往往无法稳定形成，这是因为残基的均方根波动较大[12]、[13]。这类不匹配甚至可能引发不利的构象张力，最终破坏界面的稳定性。
由于可卡因酯酶具有高效水解可卡因的能力，因此被视为治疗可卡因过量的潜在候选物[14]。然而，野生型CocE在37℃条件下的半衰期仅为约11±0.9分钟，这种热不稳定性严重限制了它的临床应用潜力。为了提高其稳定性，研究人员在C196和C301之间引入二硫键，创建了四倍体突变体E196–301（T172R/G173Q/L196C/I301C），试图形成稳定的二聚体。但在37℃条件下的体外热稳定性测试显示，该突变体的活性在孵育的第一小时内就下降了20%。虽然后续的活性下降速度有所放缓，但初始的急剧下降表明所形成的二聚体构象存在缺陷[15]、[16]、[17]、[18]、[19]。这一案例凸显了仅依赖静态结构信息来设计二硫键的局限性，在实际的灵活环境中，由于空间位阻和构象波动，预设的二硫键往往难以有效形成，这会导致产物异质性增加，进而影响其整体稳定性和在体内的持久性。因此，要成功设计有效的二硫键，就需要超越静态结构分析，综合考虑能量评估和动态构象变化[20]、[21]。
不过，即便考虑了动态因素，二硫键本身的刚性共价约束仍可能限制其在灵活界面上的应用。在这种情况下，化学交联策略展现出独特的优势。与刚性二硫键的“非此即彼”特性不同，合成交联剂可以通过提供可调节的“空间桥梁”来实现更牢固的亚基连接[22]。交联通过化学反应在酶分子之间形成共价键，促使多个酶分子聚集形成交联酶聚集体（CLEA），从而提升酶的稳定性[23]、[24]、[25]。最常用的交联剂是戊二醛，因为它价格低廉且易于大量获取[26]。然而，戊二醛交联形成的聚合物通常具有无序结构，这可能会造成空间位阻，干扰酶与底物的正常结合，从而导致交联后酶的活性下降[27]、[28]。为了解决传统CLEA技术的随机性问题，研究人员开始引入理性设计理念，根据蛋白质结构信息选择具有合适臂长的交联剂[29]、[30]、[31]。在这一理性设计的基础上，针对战略性引入的半胱氨酸残基使用双马来酰亚胺类交联剂进行定点化学交联，已被证明是一种成熟且高效的策略。事实上，这些双马来酰亚胺交联剂在以往的研究中被广泛用于稳定蛋白质结构、研究弱相互作用复合物的构象动态，以及显著延长生物催化剂的活性持续时间[32]、[33]、[34]、[35]。
尽管双马来酰亚胺类交联剂已展现出巨大潜力，但结构优化过程仍然面临着蛋白质工程固有的一个根本性挑战：静态交联剂的选择往往无法适应残基间距离的动态变化。为了解决这个问题，受那些关于自适应共价连接能够跨越次优界面几何结构并提升酶的溶解度、活性和生物催化效率的研究成果启发[36]、[37]，我们提出将分子动力学模拟纳入其中，以绘制溶液中蛋白质的构象集合和距离分布图，从而更有针对性地选择交联剂。这种选择需要精确的空间平衡：交联剂的间隔臂必须足够长，以便跨越分子动力学模拟确定的残基间间隙，同时又要有足够的约束力，能够有效地固定亚基并赋予结构稳定性。通过使交联剂的几何结构与界面拓扑结构相适配，就可以有效避免因二硫键不匹配而产生的构象应力，进而保持酶的天然灵活性和催化能力。
基于这些见解，本研究提出了一种基于计算指导的交联策略，用以克服CocE突变体E196–301的拓扑瓶颈和界面刚性问题。这种方法融合了计算结构动力学和成熟的化学工具。我们没有依赖静态结构近似值，而是首先通过分子动力学模拟绘制了界面?动态构象集合。随后，我们合理选择了具有最佳间隔长度的交联剂，使其与这种动态的界面几何结构相匹配，从而以共价方式稳定有利的二聚体构象，在保持催化活性的同时最大化稳定性。通过使用间隔臂长度为8.06埃的双马来酰亚胺乙烷（BMOE），我们构建了一种专门为匹配模拟中观察到的C196与C301之间9.10埃的动态间距而设计的自适应桥梁。再结合对具有竞争作用的表面半胱氨酸残基的理性去除（突变体T172R/G173Q/L196C/I301C/C107S/C551S，简称E107–551），这种基于计算指导的方法成功形成了均匀且极为稳定的可卡因酯酶同源二聚体（CocE-HD）。该二聚体的体内血浆半衰期和可卡因清除能力远高于单体形式，从而证明了在酶工程中将交联剂化学与动态界面拓扑结构相结合的有效性。
章节要点
材料
编码E196-301的cDNA是在之前的研究中制备的。用于Ni-NTA亲和层析的HisSep Ni-NTA琼脂糖树脂购自中国上海的Yeasen生物技术公司。BMOE购自中国西安的Ruixi生物技术科技有限公司。DTT和TCEP购自中国上海的Beyotime生物技术科技有限公司。可卡因由中国上海的Yuansi标准科学技术公司提供。抗His一级抗体购自中国杭州的
为提升交联选择性和蛋白质稳定性而对CocE进行的理性设计
为确保定点交联的精确性并防止非目标结合，我们将CocE突变体E196–301的两个暴露在表面的半胱氨酸残基（C107和C551）替换成了丝氨酸。这样就得到了六倍体突变体E107–551（C107S/T172R/G173Q/L196C/I301C/C551S）。随后通过AlphaFold 3和分子对接预测，明确了E107–551的同源二聚体结构。在CocE-HD的三种预测二聚体构型中，C1961–C3012构型是
结论
用于稳定蛋白质二聚体的传统策略往往依赖于引入刚性的分子间二硫键。然而，这种“静态”方法常常因为固定的共价键长度与蛋白质界面固有的动态波动之间存在本质的拓扑不匹配而失败[11]。正如本研究中刚性CocE突变体表现出的不佳稳定性所示，施加这样的几何约束反而会带来不利的内能惩罚，而非
CRediT作者贡献说明
Xingyu Deng：写作——初稿撰写、验证、方法学、实验研究、正式分析、数据整理、概念构思。Zhiguo Wang：写作——审稿与编辑、软件使用、资源获取、正式分析。Yuxin Hou：方法学、实验研究、正式分析、数据整理。Nuo Xu：验证、方法学、数据整理。Zhenzhen Li：验证、实验研究、数据整理。Qi Hu：实验研究、数据整理。Nan Mo：实验研究、数据整理。Ziying Ren：验证、实验研究。
伦理审批与参与者同意声明
所有动物实验均获得了中国杭州师范大学动物伦理委员会的批准。
利益冲突声明
所有作者均声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
致谢
本研究得到了STI2030重大项目（编号2022ZD0214600）、杭州师范大学的跨学科研究项目（编号2025JCXK02，资助对象为X. Chen）以及地方科技发展专项指导计划（编号2025ZY01109，资助对象为J. Wang）的支持。此外，本研究还得到了杭州师范大学高级计算中心的支持。
