利用ZenoSWATH-MS技术对鱼类过敏原β-小清蛋白（β-PRVB）诱导的细胞应答进行蛋白质组学表征

《International Journal of Biological Macromolecules》：Proteomic characterization of cellular responses to the fish allergen β-parvalbumin using ZenoSWATH-MS

　　

摘要：
鱼类过敏是重要的公共卫生问题，其中β-小清蛋白（β-parvalbumin, β-PRVB）是主要的鱼类过敏原。为了阐明细胞对β-PRVB的应答机制，研究人员建立了一个β-PRVB诱导的鱼类过敏小鼠模型，并利用基于数据非依赖性采集（Data-Independent Acquisition, DIA）的ZenoSWATH-MS定量蛋白质组学技术，绘制了过敏原再暴露后脾细胞的蛋白质组学图谱。在该模型中，通过腹腔注射β-PRVB与氢氧化铝（Al(OH)₃）佐剂成功致敏BALB/c小鼠，随后通过饮水进行口服激发。致敏效果通过检测到β-PRVB特异性免疫球蛋白E（IgE）和免疫球蛋白G1（IgG1）抗体、血清小鼠肥大细胞蛋白酶-1（mMCP-1）水平升高以及脾细胞在体外再刺激后产生Th2型细胞因子（白介素-4（IL-4）、白介素-5（IL-5）、白介素-13（IL-13））得到证实。蛋白质组学分析鉴定出324个在致敏小鼠脾细胞经β-PRVB再刺激后差异表达的蛋白质（Differentially Regulated Proteins, DRPs）。功能富集分析显示，这些DRPs显著富集于蛋白酶体/免疫蛋白酶体通路、抗原加工与呈递、T细胞活化以及Th1/Th2细胞分化等生物学过程和通路。蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-Protein Interaction, PPI）网络分析进一步揭示了与免疫应答相关的关键蛋白簇，包括蛋白酶体复合物、细胞骨架重塑和翻译调控相关蛋白。特别值得注意的是，免疫蛋白酶体亚基（Psmb8, Psmb9, Psmb10, Psme1, Psme2）以及参与抗原呈递（H2-Ab1, H2-Ea）、T细胞活化（Il2ra）和信号转导（Stat5a, Rbpj）的蛋白质表达上调。这些发现表明，β-PRVB再暴露触发了涉及免疫蛋白酶体激活、抗原加工增强以及JAK/STAT和Notch信号通路参与的协同分子应答，这可能放大了对鱼类过敏原的致敏和反应。本研究建立的模型和蛋白质组学图谱为未来比较不同过敏原的致敏性、发现生物标志物以及开发基于食物加工的风险降低策略提供了一个有价值的平台。

论文解读：

**研究背景与现存问题**
食物过敏，尤其是鱼类过敏，是重要的公共卫生问题。鱼类过敏主要由免疫球蛋白E（IgE）介导，β-小清蛋白（β-parvalbumin, β-PRVB）被认为是主要的鱼类过敏原。尽管其致敏性已被认识，但细胞在应答鱼类过敏原β-PRVB过程中的具体分子机制，特别是细胞内信号通路和免疫细胞活化的调控网络，仍不甚明了。传统的过敏研究多依赖于有限的生物学指标，缺乏系统层面的分子图谱。因此，有必要建立一个可靠的动物模型，并结合先进的组学技术，全面解析过敏原暴露后的细胞应答网络，这对于深入理解过敏发病机制、发现干预靶点具有重要意义。

**研究概述与意义**
本研究发表在《International Journal of Biological Macromolecules》上，旨在利用高分辨率定量蛋白质组学技术ZenoSWATH-MS，系统表征小鼠脾细胞对鱼类主要过敏原β-PRVB的应答。研究人员首先成功建立了一个β-PRVB诱导的鱼类过敏小鼠模型，该模型呈现出典型的IgE介导的食物过敏特征。随后，他们应用基于数据非依赖性采集（DIA）的ZenoSWATH-MS技术，对致敏小鼠在过敏原再暴露后的脾细胞进行了全面的蛋白质组学分析，构建了与过敏原驱动免疫活化相关的细胞内信号网络图谱。这项工作不仅为鱼类过敏机制研究提供了新的分子见解，其整合模型与组学数据的框架也为未来进行过敏原比较研究、生物标志物发现和食物风险评估策略开发奠定了重要基础。

**关键技术方法**
研究人员主要采用了以下关键技术：1. 建立β-PRVB过敏小鼠模型：使用5周龄雌性BALB/c小鼠，通过腹腔注射纯化的β-PRVB（来自Merluccius merluccius鱼的白肌）与氢氧化铝佐剂进行致敏，随后通过饮水进行口服激发。2. 免疫学检测：通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清中β-PRVB特异性IgE、IgG1抗体和肥大细胞脱颗粒标志物mMCP-1的水平，并检测脾细胞培养上清中Th2型细胞因子（IL-4, IL-5, IL-13）的分泌。3. 高通量蛋白质组学分析：从各组小鼠（对照组、佐剂组、单独β-PRVB组、β-PRVB+佐剂组）分离脾细胞，部分进行体外β-PRVB再刺激。使用iST试剂盒提取总蛋白并酶解为肽段。采用连接Evosep One液相系统的ZenoTOF 7600质谱仪，运行优化的ZenoSWATH DIA方法进行数据采集。使用DIA-NN软件（v1.8.1）进行无库（library-free）数据分析，鉴定并定量蛋白质。通过t检验筛选差异表达蛋白（DRPs，阈值：倍数变化≥1.5，p≤0.05）。4. 生物信息学分析：对DRPs进行基因本体（GO）富集分析、京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析以及基于STRING数据库的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析，以阐释其生物学功能和相互作用。

**研究结果**
1. **β-PRVB诱导的鱼类过敏小鼠模型的建立**：只有使用β-PRVB与佐剂（PRVB/Alum组）致敏的小鼠产生了显著的β-PRVB特异性IgG1和IgE抗体应答，并且口服激发后血清mMCP-1水平显著升高（约7倍），表明成功建立了具有IgE介导急性过敏反应特征的小鼠模型。
2. **致敏脾细胞再刺激诱导Th2型应答**：来自PRVB/Alum致敏小鼠的脾细胞在体外经β-PRVB再刺激后，IL-5和IL-13的分泌水平显著升高，证实了Th2型免疫应答的诱导。
3. **脾细胞蛋白质组对β-PRVB应答的差异分析**：ZenoSWATH-MS共定量了5468个蛋白质。比较分析显示，PRVB/Alum组（无论是否再刺激）相较于其他对照组，其脾细胞蛋白质组变化最为显著。特别地，比较致敏小鼠再刺激与非再刺激脾细胞（PRVB/Alum_RE vs. PRVB/Alum_NotRE），鉴定出324个DRPs（302个上调，22个下调）。
4. **差异表达蛋白的功能与通路富集**：GO分析表明，这些DRPs显著富集于蛋白酶体蛋白质分解代谢过程、抗原加工与呈递、T细胞活化与增殖等生物学过程。KEGG通路分析进一步显示，DRPs显著富集于蛋白酶体/免疫蛋白酶体通路、抗原加工与呈递、Th1和Th2细胞分化等通路。
5. **关键蛋白与分子特征的识别**：
* **免疫蛋白酶体激活**：多个免疫蛋白酶体亚基（Psmb8/β5i, Psmb9/β1i, Psmb10/β2i）及其激活因子（Psme1/PA28α, Psme2/PA28β）表达上调，提示过敏原再暴露增强了抗原加工能力。
* **抗原呈递与T细胞活化相关蛋白**：主要组织相容性复合体II类分子（H2-Ab1, H2-Ea）、白介素-2受体α链（Il2ra/CD25）表达上调，这与增强的抗原呈递和T细胞受体信号传导一致。
* **关键信号通路节点**：信号转导与转录激活因子5A（Stat5a，参与JAK/STAT通路）和重组信号结合蛋白（Rbpj，参与Notch信号通路）表达上调，这两个通路在Th2细胞分化、细胞因子产生和肥大细胞生物学中发挥重要作用。
6. **蛋白质-蛋白质相互作用网络**：PPI网络分析揭示了DRPs之间高度互联，形成了多个功能簇，包括最大的蛋白酶体/免疫蛋白酶体簇，以及涉及翻译调控、细胞骨架重塑、戊糖磷酸途径和细胞周期调控的簇，共同勾勒出过敏应答期间脾细胞活化的协同分子程序。

**讨论与结论总结**
讨论部分指出，本研究成功整合了具有膳食暴露特征的鱼类过敏小鼠模型与先进的DIA蛋白质组学技术，提供了过敏原再暴露后脾细胞应答的系统级视图。研究结果强调了免疫蛋白酶体在鱼类过敏原应答中的潜在核心作用，其上调可能通过影响抗原加工和免疫细胞活化来放大Th2型免疫反应。同时，JAK/STAT和Notch信号通路关键蛋白的上调，为理解β-PRVB如何驱动Th2极化及效应细胞（如肥大细胞）应答提供了新的分子线索。这些发现不仅加深了对鱼类过敏机制的理解，也为开发针对这些通路的新型治疗策略（如免疫蛋白酶体或JAK抑制剂）提供了理论依据。研究也指出了局限性，如蛋白质组数据来自混合脾细胞群体，未来需要细胞类型特异性验证；结论主要基于相关性分析，因果关系有待功能实验证实；以及从小鼠模型到人类患者的转化意义需进一步评估。

**研究结论翻译**：
研究人员阐明了利用高分辨率DIA蛋白质组学技术揭示细胞对鱼类过敏原β-小清蛋白（β-PRVB）的应答。为此，他们建立了一个具有IgE介导食物过敏特征（过敏原特异性IgE和IgG1、mMCP-1升高以及Th2相关细胞因子分泌）的β-PRVB致敏小鼠模型，并采用基于DIA的ZenoSWATH-MS技术来捕捉过敏原再暴露触发的蛋白质组学景观。所有鉴定出的DRPs均经过PPI分析，以构建β-PRVB过敏应答期间免疫细胞信号传导的整合模型。免疫蛋白酶体组分（Psmb8、Psmb9、Psmb10、Psme1和Psme2）的协同上调，以及与抗原呈递和辅助T细胞分化相关的蛋白质（H2-Ab1、H2-Ea、Il2ra、Rbpj和Stat5a）丰度的增加，共同鉴定出一个与增强的过敏原加工和2型相关信号传导一致的分子特征，该特征在过敏原特异性IL-4、IL-5和IL-13分泌的背景下得到独立证实。这可能导致更强大或更持久的免疫激活，从而放大对鱼类过敏原的致敏和反应性。从食物过敏原的角度来看，这些数据不仅提供了机制上的见解，还建立了一个定量框架，使得能够更精确地剖析2型免疫机制，用于比较不同鱼类过敏原、蛋白质制备物以及未来旨在调节致敏性的食物加工策略所驱动的分子状态。