《ACS Applied Materials & Interfaces》：Tiered Evaluation of Carbosilane Dendrimer–siRNA Nanoplatform from Single-Cell Biocompatibility to Blood-Brain Barrier Model Dynamics and Murine Alzheimer Model Behavior Assessment
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血脑屏障（BBB）转运仍然是实现阿尔茨海默病（AD）治疗药物可预测性中枢神经系统（CNS）暴露的主要制约因素，这促使研究人员对具有屏障分辨能力和功能相关性终点的递送平台进行评估。研究人员对一种碳硅烷树枝状大分子（G3Si PEG6000）及其siRNA树枝状复
血脑屏障（BBB）转运仍然是实现阿尔茨海默病（AD）治疗药物可预测性中枢神经系统（CNS）暴露的主要制约因素，这促使研究人员对具有屏障分辨能力和功能相关性终点的递送平台进行评估。研究人员对一种碳硅烷树枝状大分子（G3Si PEG6000）及其siRNA树枝状复合物（dendriplex）进行了分级、上游策略评估，涵盖细胞内化、DNA损伤筛选、BBB模型完整性与通透性，以及体内AD相关小鼠模型的学习行为。在细胞层面，该树枝状大分子增强了与siRNA相关的细胞内信号，主要表现为细胞质定位，且siRNA复合化相对于非复合载体 attenuated genotoxicity（减轻遗传毒性）。在三培养BBB模型中，屏障功能得以保留，未出现持续的跨内皮电阻（TEER）下降，补充的示踪剂通量读数显示出时间和配方依赖性的非单调变化，包括与TEER-通透性解耦现象，这与非均匀扰动及屏障相关细胞旁响应的时间依赖性变化一致。在APOE4敲入小鼠中，树枝状复合物处理增加了Morris水迷宫探测试验中平台区域的穿越次数，而目标象限停留时间仅显示出轻微的非显著性趋势。综合来看，这些整合结果表明，siRNA复合化改善了G3Si PEG6000在BBB相关安全性-性能平衡方面的表现，并支持开展将脑暴露和靶点参与与认知结局直接关联的进一步研究。
阿尔茨海默病（AD）作为一种多因素神经退行性疾病，其病理机制涉及遗传易感性（如APOE和APP变异）与环境或衰老相关应激因素的共同作用，最终导致突触失效、进行性神经退行性变和痴呆。在淀粉样蛋白（amyloid-β, Aβ）为中心的路径中，淀粉样前体蛋白（APP）经β位点APP切割酶1（BACE1）和γ-分泌酶顺序切割，产生可寡聚化并沉积为细胞外斑块的Aβ肽。同时，Aβ和APP衍生片段可放大激酶与磷酸酶失衡及炎症信号，促进tau蛋白过度磷酸化、分泌、细胞摄取及沿突触连接神经元通路的传播，使tau蛋白从微管稳定蛋白转变为聚集倾向性物种，形成神经原纤维缠结（NFTs）并破坏轴突和突触通讯。这些过程与慢性神经炎症和血管功能障碍共同导致突触失效、神经元丢失、脑萎缩，临床表现为记忆丧失、失语、失认、视空间障碍、批判性思维和计算能力缺陷，以及人格和行为改变。
越来越多的证据支持早期脑血管损伤，特别是血脑屏障（BBB）功能障碍，作为疾病连续体的上游贡献者而非仅仅是下游后果。多组独立证据将BBB破裂确定为AD早期血管异常，这一结论经神经影像学记录并由动物模型和死后人体组织分析证实。在此背景下，"双打击"血管假说提出，血管危险因素和衰老驱动的初始损伤导致BBB破坏、毛细血管低灌注和微循环功能障碍，使血液来源的神经毒性/促炎因子进入脑内；这种改变的微环境进而促进以Aβ累积、tau病理和进行性神经退行性变为标志的第二重损伤。尽管机制理解取得重大进展，已批准的药物疗法仍然主要是对症性的。乙酰胆碱酯酶抑制剂（多奈哌齐、卡巴拉汀、加兰他敏）可逆性增加突触乙酰胆碱并短暂增强胆碱能信号，部分患者可获得认知和日常功能的轻度改善或短期稳定，但无法改变潜在疾病生物学。美金刚作为中度至重度AD批准的N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体拮抗剂，以非竞争性、电压依赖性阻断方式优先减弱持续性病理NMDA受体激活和钙介导的兴奋毒性，同时基本保留生理性谷氨酸能传递。因此，当前标准治疗药物仅能提供有限的症状缓解，无法阻止疾病进展。
临床试验领域涵盖多种机制导向策略，包括针对神经炎症、突触韧性和神经保护、氧化损伤以及淀粉样蛋白和tau相关过程的疗法。截至2026年2月ClinicalTrials.gov注册数据显示，共有164项处于I至IV期的活跃干预性AD研究，其中I期13项、II期38项、III期22项、IV期6项。抗Aβ单克隆抗体如阿杜那单抗（Aduhelm）、仑卡奈单抗（Leqembi）和多纳奈单抗（Kisunla）已获加速或有条件批准，代表首批FDA批准的抗Aβ免疫治疗药物。这些抗Aβ单克隆抗体可减少斑块负荷并在早期AD中实现具有统计学意义的轻度临床减缓，然而其药代动力学分析强调，血脑屏障严重限制了有效的CNS暴露。阿杜那单抗被认为可穿越BBB，因为脑浓度似乎与小鼠血浆水平相关，但报道的脑/血浆比值约1 μL/g，远低于估计的约10-15 μL/g脑血浆容积。这一数量级不匹配意味着大部分测量信号可用局限于残余血容积中的抗体来解释，而非实质性穿透。因此，若不校正残余血容积，脑摄取估计可能高估跨BBB的有效递送，并可能助长"CNS生物制剂无需专用BBB转运技术"的误解。AD的合理治疗设计日益转向将BBB明确纳入作为核心设计参数的策略，而非仅将其视为被动背景。
值得注意的是，疾病驱动的BBB破坏并不会被动增强治疗药物向退化脑区的可及性；相反，血管损伤和BBB病理对有效药物分布构成严重阻碍。神经退行性血管损伤的报道特征包括内皮变性、紧密连接和黏附连接蛋白表达改变、非特异性转胞吞增加、转运体失调、周细胞丢失、血管周血液来源蛋白积聚以及持续性神经炎症，这些均可改变溶质处理和组织微环境特性。在此条件下，水和溶质在扩大的血管周间隙中积聚，损害细胞外液的正常形成、对流和扩散，使外源性治疗药物倾向于与血液来源的碎屑一起被隔离，而非以有效浓度到达神经元靶点。此外，载体介导和受体介导转运途径的功能障碍或下调，可进一步限制依赖这些途径的底物的递送。因此，虽然短暂和受控的BBB开放（如聚焦超声联合静脉微泡）可增强特定情况下的区域性药物或基因递送，但慢性或弥漫性BBB破坏似乎促进神经退行性级联反应并损害治疗分布，而非可靠的递送促进因素。
考虑到BBB功能障碍作为神经退行性上游贡献因素的日益增多的认识，研究人员优先选择将AD风险与神经血管单元病理机械性联系的靶点。多种AD相关风险基因具有血管生物学、内吞和屏障维持功能（如PICALM、BIN1、CD2AP、RIN3、FMNL2），支持面向BBB的靶点选择。特别是，APOE ε4是晚发性AD最强的常见遗传风险因素，与结构和功能血管异常相关，包括受影响的脑区域中基底膜形态改变和血浆来源蛋白渗漏，有证据表明这些变化可导致血流调节障碍和独立于典型AD病变的认知下降。机制研究报告APOE ε4可促进BBB破坏、减少脑血流量，并通过周细胞相关的亲环蛋白A和基质金属蛋白酶9信号通路独立促成神经元损伤，对ZO-1和occludin等连接蛋白产生下游效应。同时，APOE ε4异构体可通过受体介导机制损害淀粉样蛋白稳态，减缓Aβ清除。这些证据共同促使研究人员采用等位基因选择性RNA干扰（RNAi）方法，利用小干扰RNA（siRNA）优先沉默载脂蛋白E4（APOE4），以期在神经血管界面和脑实质内缓解AD相关病理。
在此背景下，纳米颗粒平台提供模块化载体，其尺寸、架构和表面化学可根据BBB通透性及底层架构和生理学进行理性工程化设计，使治疗策略能够同时影响BBB和脑实质。表面配体可用于参与受体或载体介导的转胞吞，而阳离子或两亲性涂层可支持吸附介导的转胞吞。研究人员合成了一种第三代碳硅烷树枝状大分子，具有硅核心和PEG6000接枝（Dendrimer G3Si PEG6000）。该纳米系统设计提供与转胞吞转运机制兼容的尺寸分布，以及适合核酸货物偶联或复合化的高密度末端基团，同时限制可能损害生物相容性的过量表面电荷。聚乙二醇化（PEGylation）旨在改善生物介质中的胶体稳定性，减少调理化和非特异性蛋白结合，延长体循环时间，从而增加脑暴露概率同时限制外周脱靶相互作用。
本研究在证据权重智能测试策略和综合测试评估方法（ITS/IATA）框架下进行，符合OECD指导和ISO/TR 16197对制造纳米材料毒理学筛选的建议，整合了一组协调的终点，涵盖遗传毒性评估、细胞摄取、跨内皮电阻（TEER）评估的BBB完整性、BBB细胞旁通透性，以及AD小鼠模型中的空间学习和记忆。
在细胞 uptake 研究中，共聚焦显微镜显示，FITC标记的G3Si PEG6000和Cy5标记的siRNA形成的树枝状复合物，在人脑微血管内皮细胞（HBEC-5i）中3小时即显著增强siRNA相关红色荧光信号，24小时进一步增加约1.6倍，而游离siRNA几乎无信号。引人注目的是，非复合树枝状大分子信号主要位于核外，但少数点状结构可与核区重叠；而树枝状复合物中，Cy5-siRNA和树枝状大分子荧光均限制于细胞质，与RNAi执行的亚细胞结构域靶向一致。DNA损伤筛选采用快速光晕试验（FHA），非复合树枝状大分子产生显著的剂量依赖性核扩散因子（NDF）增加（0.5 μM时为3.2±0.21，10 μM时达16.85±0.20），而siRNA复合化显著减轻这一信号，树枝状复合物处理细胞NDF维持在3以下且无统计学意义，表明复合化减少了可阳离子载体分数并削弱导致链断裂读数的损伤途径。
在BBB三培养模型（星形胶质细胞-周细胞-脑内皮细胞）中，研究人员监测跨内皮电阻（TEER）和40 kDa FITC-葡聚糖通量以评估屏障完整性和细胞旁通透性。非复合树枝状大分子诱发浓度依赖性、非单调TEER响应：最高浓度在24小时出现轻度短暂TEER下降（对照的90.25%±6.71%），随后恢复并在第5天达到峰值过冲（136.85%±26.14%）。相反，等浓度树枝状复合物未引起早期下降，并在后期产生进行性、统计显著的TEER持续升高（第12天达149.00%±9.62）。然而，TEER与通透性读数出现解耦：第3天时，最高浓度非复合树枝状大分子和匹配树枝状复合物均增加大分子通透性（分别为对照的175.51%±28.90%和163.71%±32.40%），而TEER无显著降低，反映离子电阻与大分子泄漏之间的功能解耦，提示存在空间受限或大分子许可的短暂渗漏途径。至第5天，最高浓度树枝状复合物将葡聚糖通量降至对照的61.00%±4.37%，与TEER过冲同步，提示屏障特性延迟改变；而亚毒性非复合树枝状大分子在长期暴露后增加葡聚糖通量（2.5 μM时为164.70%±25.60%）。
在体内心功能评估中，采用Morris水迷宫（MWM）评估APOE4敲入（KI）小鼠的空间学习和参考记忆。8周龄起始，每周一次注射，持续63天（共9次），随后进行行为测试。结果显示，接受PBS的APOE4 KI小鼠表现劣于C57BL/6 PBS对照，证实模型条件适合检测APOE4相关认知脆弱性。树枝状复合物处理的APOE4 KI小鼠在探测试验中平台区域穿越次数显著增加，而目标象限停留时间仅呈数值增加趋势且未达统计学意义。这一分离可能源于穿越次数对精确搜索焦点更敏感，而象限时间可被异质性策略和非认知因素稀释。裸siRNA处理未改善任何探测终点，与未配方siRNA在体内快速核酸酶降解和系统清除的固有限制一致。
结论部分，研究人员指出AD临床治疗进展缺乏广泛可转移的、在BBB约束下可靠实现可预测、分室适当中枢神经系统暴露的方法。本研究通过阶梯式模型递进，将细胞响应、屏障完整性指标和体内结局联系起来，在此转化框架内评估RNAi纳米系统。在细胞层面，树枝状大分子作为高效递送载体，显著增强细胞内siRNA积累；DNA损伤筛选显示非复合载体产生显著剂量依赖性NDF增加，而siRNA复合化减轻该信号。在毛细血管加权的三培养BBB模型中，两种配方均未引起TEER持续下降，树枝状复合物避免早期TEER下降并表现后期进行性升高。大分子通量试验揭示早期解耦现象，后期树枝状复合物降低葡聚糖通过量。体内Morris水迷宫探测试验中，树枝状复合物处理增加平台区域穿越次数。综合这些结果，siRNA复合化改善了G3Si PEG6000的BBB相关安全性-性能平衡，支持进一步开展将脑暴露和靶点参与与认知结局直接关联的研究。然而，行为学发现不能特异性归因于APOE4沉默，应被解释为探索性治疗相关效应，明确机制关联需要脑暴露测量和靶点参与试验。
