ERK2(细胞外信号调节激酶2)基因功能获得性激活重现Rasopathy综合征小鼠的核心神经发育特征

《Human Genetics and Genomics Advances》：Genetic activation of ERK2 recapitulates core neurodevelopmental features of Rasopathy syndromes in mice

　　

摘要：Ras/丝原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase, MAPK)通路的种系致病性变异激活可导致一类称为Rasopathy的神经发育性疾病。由于许多致病蛋白直接调控Ras， causative mutations除影响MAPK信号外还可能改变其他Ras依赖性通路。为明确Rasopathy哪些表型源于下游MAPK过度激活，研究人员构建了终端MAPK基因Mapk1(编码ERK2，与近期描述的MAPK1-related Rasopathy, MRR相关)的功能获得性突变小鼠。Mapk1突变小鼠成功模拟了人类MRR表型的核心方面，包括身材矮小、面部畸形及认知功能受损。重要的是，其重现了上游Ras激活的Rasopathy模型(如Ⅰ型神经纤维瘤病Neurofibromatosis type 1, NF1)中的表型：少突胶质细胞谱系缺陷、反应性星形胶质细胞增生、记忆缺陷及感觉刺激过敏。这些发现强调下游MAPK信号在Rasopathy综合征神经认知症状病理生理机制中的重要性。

本文发表于《Human Genetics and Genomics Advances》。

【研究背景】

Ras/丝原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase, MAPK)级联调控细胞生长、分化与应激反应，其终端激酶为ERK(Extracellular Signal-Regulated Kinase, 细胞外信号调节激酶)。种系MAPK通路激活突变引起Rasopathy综合征家族，含Ⅰ型神经纤维瘤病(Neurofibromatosis type 1, NF1)、Noonan综合征(Noonan Syndrome, NS)、伴多发黑子Noonan综合征(NSML)、Costello综合征(CS)及心-面-皮肤综合征(CFC)，共具发育迟缓、颅面异常、先天性心脏缺陷、认知损害及肿瘤风险增高。因上游Ras激活突变可同时影响PI3K等其他Ras效应器，既往无法区分Rasopathy神经表型是否单纯由下游MAPK(ERK)过度激活所致。近期临床发现MAPK1(编码ERK2)新生错义变异导致MAPK1-related Rasopathy(MRR)，具NS样特征，但尚无哺乳动物模型。本研究旨在构建Mapk1功能获得性突变小鼠，明确ERK2过度激活本身能否重现Rasopathy神经发育表型。

【主要关键技术方法】

研究人员通过CRISPR-Cas9基因编辑在C57BL/6背景小鼠Mapk1基因引入对应人类MRR患者错义变异Ala172Val(A172V，对应人MAPK1 A174V)，获得可遗传的Mapk1^A172V杂合及纯合小鼠；以野生型同窝鼠为对照。采用Western blot检测前脑及肝组织磷酸化ERK2(pERK2)与总ERK比值验证通路激活；进行大体表型测量(体重、颅面骨阿尔新蓝-茜素红染色)、全血细胞分析与心脏组织学；行为学测试含旷场、大理石掩埋、蔗糖喷溅、明暗箱、新物体识别、莫里斯水迷宫(Morris Water Maze, MWM)、情境恐惧条件反射、24小时家笼活动监测、前脉冲抑制(Pre-Pulse Inhibition, PPI)及视威胁逼近刺激(looming-stimulus assay)；取胚胎及出生后前脑做免疫组化(IHC)标记少突胶质前体细胞(Oligodendrocyte Precursor Cell, OPC)标志物PDGFRα/Nkx2.2、成熟少突胶质细胞Myrf及反应性星形胶质细胞GFAP，并做透射电镜观察髓鞘超微结构；对出生后第15天(PD15)前脑行磷酸化蛋白质组学质谱分析与转录后修饰特征富集分析(Post-Translational Modification-Signature Enrichment Analysis, PTM-SEA)；部分纯合仔鼠经哺乳母鼠给予MEK抑制剂mirdametinib(PD0325901)验证表型可逆性；代谢组学采用核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance, NMR)检测肝与血浆代谢物。

【研究结果】

Development of a mouse model of MAPK1-related Rasopathy

CRISPR构建Mapk1^A172V小鼠，Western blot证实PD7肝及ED16.5/PD15前脑pERK2/总ERK2比值显著升高，pERK1无变化。纯合子Mapk1^A172V/A172V雄性出生后死亡率高(至PD21约52.6%)，杂合子存活但终生体重低于野生型，伴颅骨缩短、鼻骨长度减小，成年体长无差异，家笼活动与静息代谢无差异。纯合子经哺乳母鼠给予MEK抑制剂mirdametinib可恢复孟德尔比例并降低死亡率，证实表型依赖MAPK通路过度激活。该模型重现MRR患者矮小、颅面畸形特征。

Neurodevelopmental effects of enhanced ERK2 signaling in Mapk1^A172V/+mice

前脑pERK2在ED16.5、PD15、PD100持续升高，ED18.5皮层与海马下游ERK靶基因Etv5(Ets variant 5)表达区扩大。PD15前脑磷酸化蛋白质组学鉴定185个差异磷酸肽(|FC|>1.5, p<0.05)，富集Ras/MAPK信号、应激反应、突触传递通路，PTM-SEA显示ERK1/2底物磷酸化评分显著升高，确认脑内ERK活性增强。

少突胶质细胞谱系检测示PD14胼胝体PDGFRα⁺OPC数无皮层差异但胼胝体增多，皮层与胼胝体Nkx2.2⁺OPC/早期分化少突胶质细胞均增多，成熟Myrf⁺少突胶质细胞数无差异。成年(10周)胼胝体透射电镜见髓鞘脱压实(decompaction)。部分脑区(间脑、下丘脑)GFAP⁺反应性星形胶质细胞增生。表明ERK2功能获得足以引起与NF1及NS模型一致的少突胶质细胞谱系异常与反应性胶质增生。

Mapk1^A172V/+mice recapitulate spatial memory deficits and sensory hypersensitivity observed in other Rasopathy mouse models

行为学：旷场、家笼活动、大理石掩埋、明暗箱、新物体识别、情境恐惧条件反射无基因型差异。Morris水迷宫训练日与习得第1天平台寻找潜伏期延长，经更多训练后可达同等成绩，探针试验与反转学习无差异，提示海马依赖空间初始学习受损。looming-stimulus assay中突变鼠逃避率更高、受刺激后峰值速度更大、僵住潜伏期更短、僵住时长更长，且预刺激期活动无差异；声惊反射(pre-pulse inhibition intact)幅值增大；蔗糖喷溅试验理毛起始潜伏期缩短。表明ERK2过度激活致感觉(视觉、听觉、触觉)过敏，与NF1模型一致。

【讨论与结论翻译】

本研究建立了MAPK1-related Rasopathy的基因工程小鼠模型(Mapk1^A172V/+)，重现了MRR临床核心特征：身材矮小、颅面畸形及认知损害。由于Mapk1^A172V致病性变异位于ERK2激活域附近并增强激酶活性，本研究回答了Rasopathy领域一关键问题：即下游Ras效应器——终端MAPK ERK的功能获得性突变在多大程度上模拟上游或Ras水平突变的Rasopathy模型小鼠表型。研究发现，ERK2功能获得足以产生上游突变Rasopathy小鼠模型中观察到的一系列中枢神经系统细胞、组织学与功能性核心表型：少突胶质细胞谱系缺陷、反应性星形胶质细胞增生、海马依赖空间学习缺损及对唤起性感觉刺激(如逼近视觉威胁)的反应性增强。Ras/MAPK信号通路在胚胎与出生后脑发育中起关键作用，Mapk1^A172V小鼠模型将为研究下游MAPK在神经发育及Rasopathy神经发育症状中的作用提供有用工具。未来需明确异常神经发育如何导致行为表型及药物干预的时间窗，并探索Etv5等ERK靶基因在OPC异常与认知缺损中的机制。MEK抑制剂可挽救纯合子出生后死亡并已在NF1模型改善髓鞘表型，为MRR机制研究与治疗探索提供基础。