一项关于带状疱疹后神经痛中皮肤神经-免疫细胞相互作用的初步成像质量细胞术研究

《Frontiers in Immunology》：A pilot imaging mass cytometry study of cutaneous nerve-immune cell interactions in post-herpetic neuralgia

　　

带状疱疹后神经痛（PHN）是一种慢性疼痛状态，在带状疱疹后持续存在，并涉及皮节特异性异常性疼痛、残疾和心理共病。皮肤神经免疫失调与慢性疼痛的关联日益密切，但PHN的潜在机制仍不清楚。本研究首次使用成像质量细胞术（IMC）对PHN受累皮肤进行高参数成像分析。研究人员对来自PHN受累皮节（n=6）和健康对照（n=6）的皮肤活检样本，使用针对免疫细胞和神经纤维的13种标记物抗体组合进行染色。在定制化分析流程中量化了免疫细胞密度及其与神经纤维的空间邻近性。PHN受累皮肤中朗格汉斯细胞密度和皮肤归巢记忆T细胞升高。T细胞、浸润性1型辅助T样T细胞以及T细胞-神经纤维相互作用呈升高趋势。虽然巨噬细胞和树突状细胞（DC）亚群总数未改变，但抗炎巨噬细胞-神经纤维相互作用显著增加，而两种DC亚群的此类相互作用均减少，提示在神经纤维微环境中髓系细胞群体存在选择性空间重组。神经纤维密度本身未改变。这些发现表明，持续的神经免疫改变可能参与PHN病理生理学。本初步研究凸显了IMC揭示先前未被识别的、可能促成PHN的皮肤病理机制的潜力。未来应在更大样本量的基础上开展IMC研究，以指导PHN新型治疗策略的开发。

**论文解读：皮肤神经免疫相互作用在带状疱疹后神经痛中的初步成像质量细胞术研究**

**研究背景与问题**
带状疱疹后神经痛（Post-herpetic neuralgia, PHN）是水痘-带状疱疹病毒（varicella zoster virus, VZV）再激活后，在皮疹消退后持续超过三个月的慢性疼痛状态，常伴有皮节特异性异常性疼痛、残疾和心理共病。现有治疗主要针对症状缓解而非逆转病理过程，尽管疫苗接种可有效预防带状疱疹和PHN，但全球接种率因认知和经济因素差异较大。既往研究表明，PHN病理机制涉及表皮内神经纤维密度（IENFD）降低、T细胞浸润至背根神经节（DRG）等关键疼痛感知区域，但皮肤局部神经免疫相互作用的细节尚不清楚。朗格汉斯细胞（Langerhans cells, LCs）、树突状细胞（dendritic cells, DCs）、巨噬细胞和T细胞在神经病理性疼痛中起重要作用，然而在PHN受累皮肤中这些细胞与神经纤维的空间关系尚未被高参数成像技术系统研究。研究人员因此利用成像质量细胞术（imaging mass cytometry, IMC）首次对PHN皮肤进行原位多标记物成像，以揭示潜在的神经免疫机制，为治疗干预提供新靶点。该研究发表于《Frontiers in Immunology》。

**主要关键技术方法**
研究从一家小型私立疼痛诊所招募PHN患者（n=6，4名女性，年龄64-83岁），从Murdoch大学招募健康对照（health controls, HCs）（n=6，3名女性，年龄40-65岁）。皮肤活检取自PHN受累皮节中心区域（部分患者同时取对侧未受累皮节配对样本，n=3）。样本经Zamboni固定液固定、石蜡包埋（ZFPE）后，切成7μm切片。研究人员采用包含13种抗体（靶向免疫细胞、神经和结构标记物）的优化IMC抗体组合进行多重免疫标记，使用Hyperion?成像系统获取图像。数据分析流程基于IMComplete-Workflow：通过Cellpose进行细胞分割，手动勾勒表皮/真皮及神经纤维（PGP9.5⁺C3BT⁺）区域，CellProfiler计算单细胞标记物表达、邻域信息和细胞与最近神经纤维的距离（μm），以40 μm作为潜在空间相互作用阈值。细胞群体通过FlowJo层次化门控策略鉴定（如CD207⁺ LC、CD3⁺ T细胞、CD68⁺巨噬细胞等），数据标准化至1 mm²组织面积。统计采用Welch’s t检验或Mann-Whitney U检验（α=0.05），未进行多重比较校正。

**研究结果**

**皮肤神经纤维密度在PHN中未改变**
IMC检测到PHN受累皮肤和HC皮肤中均有表皮和真皮神经纤维，但两组间密度无显著差异（均p>0.05）。这与既往部分研究报道的IENFD降低不一致，可能因样本量小、活检部位、疾病阶段和方法差异所致。

**PHN中朗格汉斯细胞丰度增加，但LC-神经纤维空间邻近性未改变**
PHN受累皮肤中总LC密度显著高于HC（200.30±194.60 vs 28.78±26.11细胞/mm², p=0.0260），但表达HLA-DR（人白细胞抗原-DR）的LC密度无差异。LC与表皮内神经纤维（IENF）在40 μm内的空间相互作用频率在两组间相似（p>0.05）。LC增多可能反映皮肤免疫激活，但未伴随与神经纤维的邻近性改变。

**PHN中表达CLA的T淋巴细胞丰度增加**
PHN受累皮肤中皮肤归巢记忆T细胞（CLA⁺ T细胞）密度显著高于HC（2.59±2.15 vs 0.31±0.35细胞/mm², p=0.0479）。总T细胞密度和浸润性Th1样T细胞（CXCR3⁺）在PHN中呈升高趋势（p=0.0974和p=0.0606）。T细胞-神经纤维空间相互作用在60% PHN样本中存在，而在HC中为0%，虽未达统计学显著（p=0.0606），但提示PHN中T细胞-神经相互作用可能增强。

**巨噬细胞和树突状细胞亚群丰度无变化，但CD206⁺巨噬细胞-、CD206⁺ DC-和CD206^- DC-神经纤维邻近性改变**
PHN受累皮肤中总巨噬细胞和抗炎巨噬细胞（CD68⁺CD206⁺）密度与HC相似（均p>0.05）。总巨噬细胞-神经纤维相互作用频率无差异，但抗炎巨噬细胞-神经纤维相互作用频率显著增加（11.94±9.32 vs 2.56±4.62相互作用/mm², p=0.0390）。CD206⁺ DC和CD206^- DC密度未改变，但两者与神经纤维的空间相互作用频率均显著降低（CD206⁺ DC: 0.38±0.42 vs 4.44±8.19, p=0.0498; CD206^- DC: 2.63±2.21 vs 8.32±4.75, p=0.0335）。这表明真皮髓系细胞群体相对于神经纤维发生了选择性空间重组，而不是整体丰度变化。

**PHN受累皮节与对侧未受累配对活检位点之间神经纤维密度和免疫细胞丰度相似**
配对分析显示，IENFD、真皮神经纤维密度及所有免疫细胞群体在PHN受累与对侧未受累皮肤间无显著差异（均p>0.05），但LC、T细胞和巨噬细胞数值在受累侧略高，与既往IENFD降低趋势一致。

**讨论与结论**
这是首个利用IMC技术对PHN皮肤神经免疫相互作用进行高参数空间成像的研究。研究人员发现PHN受累皮肤中表皮内和真皮神经纤维密度与健康对照无差异，但LC和CLA⁺ T细胞丰度增加，抗炎巨噬细胞-神经纤维相互作用增强，而DC-神经纤维相互作用减少。LC增多与皮肤抗原呈递和神经源性炎症一致，可能通过适应性免疫驱动促伤害性炎症。CLA⁺ T细胞的增加提示VZV优先感染CLA⁺记忆T细胞促进病毒皮肤播散，这些细胞可能来自先前带状疱疹皮疹的驻留记忆T细胞（TRM）。抗炎巨噬细胞-神经纤维相互作用增强可能反映了促消退的补偿机制，而DC-神经纤维相互作用的减少支持髓系细胞在神经纤维微环境中的选择性空间重组模型。本研究的局限性包括样本量小、对照非完美年龄和部位匹配、临床数据不完整以及有限抗体组合。结论部分：通过运用IMC，本初步研究提供了PHN受累皮肤中LC和皮肤归巢CLA⁺记忆T细胞丰度升高、抗炎巨噬细胞-神经纤维相互作用增加以及DC-神经纤维空间相互作用减少的初步证据。这些发现提示持续的LC和T细胞激活以及真皮髓系亚群的重组可能是PHN病理生理学的贡献因素。此外，数据支持将IMC作为研究PHN皮肤神经免疫相互作用的调查工具，并为未来探索其病理机制和潜在治疗途径的研究提供依据。