一种仿生新方法用于合成具有可调控nHAP/β-TCP成分的互生纳米工程化双相磷酸钙

《Case Studies on Transport Policy》：A Novel Biomimetic Approach to Synthesize Intergrown Nanoengineered Biphasic Calcium Phosphate with Tunable nHAP/β-TCP Composition

　　安基塔·苏雷什|瓦尔沙·派|阿塔尔瓦·肯克雷|巴瓦纳·安昌|希曼苏·塞卡尔·南达|卡马莱什·达塔拉姆·穆姆贝卡尔|希亚马斯恩德·巴特·N|普拉萨普·索穆|阿吉特库马尔·帕蒂尔|比沙姆·纳拉扬·辛格

印度马尼帕尔高等教育学院马尼帕尔生命科学学院生物技术系

摘要：双相磷酸钙具有羟基磷灰石和β-三钙磷酸盐各自的优异特性，在骨组织工程领域展现出良好的临床应用前景。然而，通过机械混合羟基磷灰石与β-三钙磷酸盐来合成双相磷酸钙时，往往会导致其微观结构不均匀、相融合度差、吸收过程不均等问题。因此，如何实现能够精确控制相比例且各相紧密结合的合成方法仍是一大挑战。为解决这些问题，我们提出了一种一步法合成双相磷酸钙的方案：首先生成类似无定形磷酸钙的前体物质，再通过煅烧处理，从而得到羟基磷灰石与β-三钙磷酸盐比例可调控的双相磷酸钙。该方法利用酪蛋白等能够螯合钙离子的生物聚合物以及微波辅助技术，促进均匀成核并形成富含无定形磷酸钙的微胶粒。这些无定形磷酸钙在800℃下煅烧后转化为双相磷酸钙。通过调整合成参数，可以精确控制羟基磷灰石与β-三钙磷酸盐的比例、颗粒尺寸（纳米级）以及材料的生物活性。所合成的生物陶瓷具有不同的颗粒尺寸、形态和生物活性。对羟基磷灰石、β-三钙磷酸盐及双相磷酸钙的形态分析显示，其颗粒尺寸分别约为265纳米、560纳米以及228-340纳米。X射线衍射分析证实，加入0.25%–10%的酪蛋白后确实形成了双相磷酸钙，且其羟基磷灰石与β-三钙磷酸盐的比例可被精确调控。这类材料具有优异的生物相容性，能够有效促进间充质干细胞的成骨分化。这种可通过调节羟基磷灰石/β-三钙磷酸盐比例且颗粒尺寸为纳米级的一步法合成双相磷酸钙，具有可控的生物活性和降解速率。这一简化策略有助于实现双相特性的精准控制，为先进的骨组织再生提供了更好的成骨潜力。

1. 引言

由创伤、感染、肿瘤切除或先天性疾病引起的骨组织缺损，在骨科和重建外科领域构成了重大挑战。这类缺损往往超出人体自身的修复能力，通常需要外部干预。正常的骨愈合过程涉及一系列复杂的细胞和分子相互作用，包括止血、炎症反应、细胞增殖、成骨作用以及骨骼重塑[1]。体积较小的缺损可以通过形成软骨痂继而实现骨组织再生而自愈[2]，但体积较大的缺损则需额外的治疗手段来恢复骨骼的结构完整性和功能。传统的骨修复方法包括自体移植、同种异体移植和异种移植。自体移植使用患者自身的骨组织，生物相容性最佳，但由于供体部位可能出现并发症且资源有限，应用受到限制。同种异体移植使用尸体骨组织，可减少上述问题，但存在免疫排斥的风险；而异种移植虽然来源为动物，却可能存在人畜共患疾病传播的隐患。由于传统移植方法存在诸多局限，人们开始研发合成生物替代物，尤其是那些具有良好生物相容性且能促进骨形成的磷酸钙基骨填充材料。此外，骨组织移植是仅次于血液的第二大常见移植组织类型，这进一步凸显了开发合成移植材料以满足全球日益增长需求的必要性[3]。

由于磷酸钙基材料在结构和化学性质上与天然骨中的矿物质成分相似，因此羟基磷灰石、三钙磷酸盐以及双相磷酸钙等磷酸钙基材料在骨修复领域得到了越来越广泛的应用[4][5]。羟基磷灰石是一种单相磷酸钙材料，以其良好的机械性能、高化学稳定性、低溶解度、优异的生物相容性以及可直接与骨结合的特性而著称[6]，但其极慢的生物降解速度会限制骨愈合过程中的骨骼重塑[7]。相比之下，β-三钙磷酸盐的生物降解速度更快，且具有更强的成骨诱导能力，能更有效地促进新骨形成。相比α-三钙磷酸盐，β-三钙磷酸盐在生理条件下的化学稳定性更高，其吸收过程也更为可预测，因此更受青睐[8][9]。β-三钙磷酸盐兼具成骨诱导和成骨传导功能，同时还能释放生物活性的钙离子和磷酸根离子，从而积极促进成骨作用和骨骼重塑[10]。双相磷酸钙则通过将羟基磷灰石与β-三钙磷酸盐按特定比例结合，充分利用了两种成分的优势。通过调整二者比例，可以平衡材料的稳定性和适当的吸收速率，使其与新骨形成过程相协调，为骨再生创造理想的微环境[5]。稳定的羟基磷灰石相可为骨骼提供长期的结构支撑，而可吸收的β-三钙磷酸盐相则能促使骨骼逐渐被吸收并形成新的骨组织。基于双相结构的双相磷酸钙材料不仅具有更强的成骨传导性、可控的降解速率、更高的生物活性，还能更好地与宿主骨骼整合。此外，其降解产物——钙离子和磷酸根离子，还能刺激细胞迁移和分化，进一步促进再生组织的成骨作用和血管生成[11]。目前已有多种合成双相磷酸钙的方法，包括固相转化法、在约1000℃下对非化学计量的无定形磷酸钙和缺钙羟基磷灰石进行烧结、火焰喷涂热解法、溶胶-凝胶法等。另一种方法是先混合适量的含钙和含磷化合物，如水滑石、方解石、一水合单钙磷酸盐和三钙磷酸盐，然后再加热烧结。此外，也有研究报道通过按适当比例机械混合羟基磷灰石与β-三钙磷酸盐来制备双相磷酸钙。不过，双相磷酸钙合成过程中存在的最大难题在于难以精确控制其相比例，混合相的晶体分布不均匀，各相的协同生长存在困难，而且当温度超过1100℃时烧结过程会限制材料的比表面积和生物活性，还有可能导致β-三钙磷酸盐发生相变转变为α-三钙磷酸盐[12][13][14]。因此，亟需一种能够在较低温度下，利用单一磷酸钙前体来合成具有可控羟基磷灰石/β-三钙磷酸盐比例的纳米级双相磷酸钙的一步法合成工艺。在本研究中，我们采用仿生策略，利用富含磷酸丝氨酸的酪蛋白聚合物作为载体来螯合钙离子。酪蛋白是一种天然存在的含磷蛋白质，具有很强的钙离子结合能力，其在调控生物矿化过程中发挥着重要作用，因此可作为矿物化组织工程的仿生模板。据我们所知，目前尚未有研究将酪蛋白用于合成能够更精确控制羟基磷灰石与β-三钙磷酸盐比例的双相磷酸钙。此外，磷酸丝氨酸是骨唾液蛋白的关键组成成分，它能促进羟基磷灰石的成核，而酪蛋白中的磷酸丝氨酸可模拟这一过程，帮助螯合钙离子，为无定形磷酸钙或缺钙羟基磷灰石的形成创造缺钙环境。进一步的热处理会使两种相在同一个反应体系中分别生成：一种相形成羟基磷灰石，另一种相则形成β-三钙磷酸盐。另外，微波辅助合成技术作为一种高效的方法，可通过快速且均匀的加热机制来制备纳米级的羟基磷灰石和缺钙羟基磷灰石[15]。该技术利用电磁波与反应介质中的极性分子或离子相互作用，实现快速的整体加热，从而加速成核和生长过程[16]。与传统方法相比，微波辅助合成能够实现能量的均匀分布，降低温度梯度，还能精确控制纳米颗粒的尺寸、形状和结晶度。凭借其高能源效率、快速处理能力以及精确的化学计量控制优势，微波辅助合成有望用于制备具有更强成骨传导性、更好降解性以及药物输送功能的羟基磷灰石和β-三钙磷酸盐纳米颗粒，进而应用于骨再生领域[17]。由于酪蛋白的一级和二级结构较为简单，它还具备一定的热稳定性[18]，因此通过微波辅助合成成功制备出了双相磷酸钙。在本研究中，酪蛋白并非仅作为添加剂使用，而是作为一种仿生模板剂，引导合成过程中磷酸钙相的成核和生长。这一策略使得对羟基磷灰石和β-三钙磷酸盐相组成的控制更加精准，从而得到了微观结构更为优化的双相磷酸钙。精确控制羟基磷灰石与β-三钙磷酸盐的比例尤为重要，因为它直接影响材料的生物活性、成骨传导性以及吸收行为。本研究通过使用不同浓度的酪蛋白聚合物（0.25%、0.5%、1%、2.5%、5%和10%），并结合微波辅助合成技术，制备了由羟基磷灰石和β-三钙磷酸盐组成的双相生物陶瓷。合成完成后，对这些生物陶瓷进行了全面的表征分析，包括形态学、物理化学性质以及生物学特性等方面的检测，最终目的是使其能够应用于骨组织工程领域。物理化学分析包括通过扫描电子显微镜观察样品形态，通过X射线衍射确定其相组成和结晶度，以及通过傅里叶变换红外光谱识别样品中的官能团。体外生物学评估则包括使用源自人类脐带组织的人类间充质干细胞进行细胞相容性测试，同时还进行了细胞黏附、细胞增殖以及成骨分化试验，以此判断这些生物陶瓷粉末是否能够支持并促进骨形成相关的细胞活动，进而评估其作为各种骨科应用材料的适用性。

2. 实验部分

材料

本研究使用了四水合硝酸钙（Ca(NO3)4·4H2O，HiMedia公司）、磷酸二氢铵((NH4)2HPO4，HiMedia公司)、酪蛋白（Sigma Aldrich公司）、刺激体液、杜尔贝克最小必需培养基（DMEM，Sigma Aldrich公司）、磷酸盐缓冲液（PBS）、Triton X-100、胎牛血清（FBS，HiMedia公司）、抗生素溶液（Sigma-Aldrich公司）、3-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT，Sigma-Aldrich公司）、二甲基亚砜（DMSO，Sigma-Aldrich公司）、碘化丙啶（PI，Sigma-Aldrich公司）、吖啶橙（AO，Sigma-Aldrich公司）、茜素红染色剂（Sigma-Aldrich公司）、十六烷基吡啶氯化物（SRL）以及碱性磷酸酶（ALP，Sigma-Aldrich公司）。

2.1 合成方法

为了合成羟基磷灰石、β-三钙磷酸盐以及羟基磷灰石/β-三钙磷酸盐双相材料，本研究采用了共沉淀湿法。四水合硝酸钙作为钙源，而磷酸二氢铵则作为磷源。在用于仿生诱导双相生物陶瓷中磷灰石晶体的成核时，研究了不同浓度下的酪蛋白磷酸肽（CPPs，浓度为0.25%、0.5%、1%、2.5%、5%和10%）。在合成双相磷酸钙时，将四水合硝酸钙与磷酸二氢铵的比例设定为1.67。先将四水合硝酸钙和磷酸二氢铵逐滴加入酪蛋白溶液中，再通过添加氨水将溶液的pH值维持在9-10之间。将混合液搅拌2小时，随后在Raga Scientific公司的微波炉中对其进行微波辅助处理，微波功率控制在140–350瓦之间，此时溶液的温度在80分钟内从50℃上升至120℃。微波处理结束后，继续将沉淀物搅拌2小时，然后以16,000×g的离心力离心15分钟。得到的沉淀物先用乙醇洗涤两次，再用蒸馏水洗涤两次，每次洗涤后都需以16,000×g的离心力离心15分钟。最后将沉淀物在-108℃、0.02 mBar的压力下进行冷冻干燥，从而得到羟基磷灰石/β-三钙磷酸盐的粉末。将该干燥后的粉末在800℃下煅烧4小时，这一热处理过程有助于彻底分解并去除其中的有机成分，包括酪蛋白。对于羟基磷灰石和β-三钙磷酸盐的合成，也采用了相同的流程，只不过羟基磷灰石对应的钙磷比例定为1.67，而β-三钙磷酸盐的比例则为1.5。另外，合成羟基磷灰石和β-三钙磷酸盐时未在反应体系中加入酪蛋白，而它们的煅烧温度分别为800℃和1100℃，煅烧时间均为4小时，具体流程如图1所示。

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图1. 生物陶瓷材料羟基磷灰石、β-三钙磷酸盐及双相磷酸钙的合成过程示意图。

2.2 形态学表征

通过加速电压为3–5千伏的场发射扫描电子显微镜（JEOL JSM-7610FPlus型，FESEM）对所合成的生物陶瓷样品的形态学特征进行了分析。制备样品时，先将少量粉末分散在金属基底上，再通过溅射方式在其表面覆盖金颗粒。在不同的放大倍数下对样品进行观察并采集图像。同时，还利用扫描电子显微镜和能量色散X射线光谱仪来确定样品的元素组成。通过ImageJ软件根据FESEM图像计算样品的颗粒尺寸，而能量色散X射线光谱分析则在暗场模式下进行，电压设置为8千伏，扫描时间为2分钟。样品的颗粒尺寸、分散状态以及Zeta电位则是通过Malvern Panalytical公司的Zetasizer Nano ZS90仪器测定的。将浓度为0.5毫克/毫升的样品悬浮在蒸馏水中，然后进行5分钟的超声处理。在样品悬浮液温度升至25℃后立即进行相关分析。

2.3 FTIR和XRD分析

使用JASCO公司的FT/IR-4X型傅里叶变换红外光谱仪对所合成的粉末样品进行了傅里叶变换红外光谱分析。约0.2克的样品被放置在盘状载板上，然后使用ATR红外光谱法在4000–400 cm?1范围内对其进行分析。SpectraGryph 1.2软件被用来平滑图表、校正基线以及分析光谱图。通过RIGAKU MiniFlex 600仪器进行的X射线衍射（XRD）分析，用于评估所合成的nHAP、β-TCP和BCP样品的晶体结构与物相。实验中使用了Cu–Kα辐射源，以及设置为1.0°/1.0°/1.0°的衍射光束单色仪和特定孔径光阑，而衍射光束单色仪的光阑则设定为0.15°和0.6°。XRD测量在2θ为5–70°的范围内进行，扫描速率为每0.03°5秒。所得到的衍射图案是通过ORIGIN软件进行分析的。HAP和β-TCP的相对物相组成则是利用PANalytical X’Pert HighScore Plus软件根据XRD数据来确定的。该软件通过参考数据库匹配（JCPDS）来执行物相识别和半定量分析，HAP的参考文件号为JCPDS 01-086-0740，β-TCP的参考文件号为JCPDS 01-086-1585。本研究中报告的物相百分比是通过X’Pert HighScore的半定量分析功能得出的，该功能通过比较各特征衍射峰的相对强度来估算各个物相的重量占比[19]。

2.4 润湿性分析
所合成的nHAP、β-TCP和BCP粉末样品的润湿性是使用接触角测定仪（Holmarc）来检测的。为了测量接触角，首先使用液压压力机（5-7吨）将每种粉末样品压成扁平的颗粒。之后，在颗粒上滴加一滴PBS溶液，再使用接触角测定仪（Holmarc）并在5秒内用高速摄像机多次测量该角度[20]。

2.5 体外生物活性分析
所合成的nHAP、β-TCP和BCP生物陶瓷粉末样品的生物活性是通过将这些粉末样品（浓度为1 mg/ml）浸泡在模拟体液（SBF）中14天后再进行XRD分析来确定的。SBF溶液是根据Kokubo等人提出的方法配制的，其中包含了Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cl-、HCO3-、HPO42-和SO42-等各种离子的生理浓度。在37°C下，通过使用三羟甲基氨基甲烷和HCL将SBF溶液的pH值调整至7.25[21]。此外，还使用pH计在特定的时间间隔内持续监测生物陶瓷浸泡后的SBF溶液的pH值，这些时间点包括2、4、6、8、10、24和48小时，之后则是3、4、5、6和7天。同时，还通过X’Pert HighScore Plus软件的XRD分析来检测浸泡后的nHAP、β-TCP以及双相生物陶瓷的物相组成变化。分析时是将实验数据与ICDD PDF-2数据库（国际衍射数据中心，2015年）中的参考光谱进行对比，HAP的参考文件号为JCPDS 01-086-0740，β-TCP的参考文件号为JCPDS 01-086-1585。通过考虑5–70°（2θ）范围内已识别的外来物相以及未识别出的反射峰，以参考HAP和β-TCP的百分比含量来表示样品的物相纯度。

2.6 溶血试验
根据ASTM F 756–00标准方法[22]，评估了这些生物陶瓷对红细胞的溶血活性。实验中收集了Sprague Dawley大鼠的新鲜血液（IAEC编号为IAEC/KMC/80/2023），然后在室温下以500 g的离心力离心10分钟。为避免干扰红细胞，需小心分离出血浆。另外，将100 mg/mL的生物陶瓷粉末浸泡在PBS中，然后在37°C下培养24小时。之后过滤该溶液以获得生物陶瓷提取物。在96孔板中，每个孔中先加入100 μL的红细胞悬浮液，然后再加入100 μL的生物陶瓷提取物。将平板在37°C下培养3小时。Triton X-100作为阳性对照，PBS则作为阴性对照。培养结束后，将平板以500 g的离心力离心10分钟，使红细胞聚集成沉淀。随后，将100 μL的上清液转移到新的平板中，再用分光光度计在540 nm波长处测量上清液的吸光度。通过计算溶血百分比来判定生物陶瓷样品的血液相容性[22]。

2.7 细胞培养
在获得Kasturba医学学院及Kasturba医院机构伦理委员会（注册编号为ECR/146/Inst/KA/2013/RR-19）以及IEC1:355/2022标准下的批准后，才对人类间充质干细胞（hMSCs）进行采集。这些细胞是从脐带的华通氏胶中分离出来，然后在10厘米的培养板中进行培养。具体来说，细胞是在添加了10%胎牛血清（FBS）、1%抗生素溶液以及0.1% GlutaMAX的Delbecco最低必需培养基（DMEM）中生长。经过7天的初始培养期后，那些没有粘附在培养基表面的细胞会被丢弃，而那些从华通氏胶中迁移过来的粘附细胞则会被进一步培养到第3代，并检测其是否具有hMSCs的阳性及阴性标记。这些获得的hMSCs随后被用于对所合成的生物陶瓷进行生物学特性分析[23]。通过一系列的特性检测，评估了在这些生物陶瓷微环境中所培养的间充质干细胞的细胞毒性、细胞增殖能力以及成骨分化潜力。这些研究旨在确认生物陶瓷的生物相容性，同时证明当间充质干细胞与生物陶瓷材料接触时，它们具备存活、增殖以及向成骨细胞方向分化的能力。

2.8 细胞活力测定
在培养1天、3天以及7天后，通过MTT试验（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物；美国Sigma-Aldrich公司产品）来评估经过nHAP、β-TCP和BCP生物陶瓷提取物处理的间充质干细胞（MSCs）的活力。在制备提取物时，先将每种生物陶瓷粉末以约20 mg/mL的浓度放入70%乙醇中消毒，之后离心并使用无菌的1X PBS洗涤三次[24]。洗涤后的样品在无菌条件下暴露于紫外线光下1小时。之后，将这些已消毒的粉末放入含有完全DMEM培养基的容器中，在37°C下培养24小时，从而得到经过生物陶瓷处理的培养基。培养24小时后，将悬浮液离心以去除残留的颗粒，上清液（即生物陶瓷提取物）被收集起来，用于后续的MSCs处理实验。在设定的时间点，用无菌的1X PBS轻轻冲洗处理过的细胞，然后向每个孔中加入20 μL的MTT溶液（在PBS中配制的浓度为5 mg/mL的储备液）。将培养板放入含有5%二氧化碳的恒温培养箱中，在37°C下培养4小时，以便代谢活跃的细胞能够形成甲瓒结晶。培养结束后，向每个孔中加入100 μL的DMSO，用以溶解甲瓒结晶。随后使用Tecan微板读数仪在570 nm和630 nm波长处测量样品的吸光度。细胞活力是通过以下公式计算得出的：此外，还进行了AO/PI染色试验，以此来评估由nHAP、β-TCP和BCP衍生而来的生物陶瓷提取物的细胞相容性。将培养在12孔板中的hMSCs用20 mg/mL浓度的生物陶瓷提取物处理，然后继续培养一周。在设定的时间点，用无菌的1X PBS轻轻冲洗处理过的细胞，以去除未粘附的细胞及杂质。接着，向细胞中加入含有0.1%碘化丙啶（PI，储备浓度为1mg/ml）和0.1%吖啶橙（AO，储备浓度也为1mg/ml）的染色溶液。将培养板置于黑暗环境中培养30分钟，以避免荧光染料因光照而褪色。染色完成后，使用奥林巴斯荧光显微镜对支架进行观察，从而区分出会发出绿色荧光（被吖啶橙染色）的活细胞和会发出红色荧光（被碘化丙啶染色）的死细胞。这一试验能够直观地显示支架上的细胞活力以及细胞毒性情况[25]。

2.9 碱性磷酸酶测定
本研究旨在通过检测ALP活性来评估HAP、β-TCP和BCP这几种生物陶瓷的成骨潜力，以此来验证它们的成骨分化能力。在标准条件下培养hMSCs，并用生物陶瓷提取物对其进行处理。作为成骨分化早期标志物的ALP，在培养7天、14天以及21天时会被检测出来，以此追踪hMSCs的成骨分化进程。为评估早期的成骨分化情况，通过比色法p-硝基苯磷酸盐（pNPP）测定法来量化ALP的活性。具体操作是，先将样品用PBS轻轻洗涤两次，然后再用0.2%的Triton X-100溶液进行裂解。将裂解液收集起来后，在4°C下以6000 g的离心力离心10分钟，以去除其中的杂质。在96孔板中，将80 μL的细胞裂解液与100 μL的pNPP底物溶液（浓度为5 mM，置于pH值为9.5的二乙胺缓冲液中，其中还含有0.5 mM的MgCl2）混合。将混合液在37°C下培养30–60分钟，之后加入50 μL的3 N NaOH来终止反应，最后使用微板读数仪在405 nm波长处测量吸光度[26]、[27]。

2.10 醋酸洋红测定
醋酸洋红S（ARS）测定法是一种常用的方法，可用于检测钙沉积情况，同时也是细胞培养过程中成骨分化与矿化程度的指标。将该方法应用于生物陶瓷时，有助于判断它们在促进骨组织形成方面的潜力。首先，将间充质干细胞接种到12孔板中，让其静置培养24小时以便细胞粘附。之后，在培养基中加入1 mL的生物陶瓷提取物，让细胞在7–21天的时间内继续培养，从而促进细胞外基质的形成以及钙的沉积。培养期结束后，用PBS仔细冲洗样品，以去除所有未粘附的细胞。接着，将细胞在37°C下用4%的多聚甲醛固定30分钟。固定完成后，用去离子水冲洗样品，以去除残留的多聚甲醛。随后，将样品在37°C下用浓度为2%的醋酸洋红S溶液（pH值被调整至4.1–4.3）染色30分钟。染色结束后，再次用去离子水彻底冲洗样品，以去除所有未结合的染料，仅留下与钙结合的染料，这部分染料的存在就反映了矿化活动的发生[28]。为了进行定量分析，可将经过染色的样品与10%的十六烷基吡啶氯化铵共同培养1小时，从而使结合在样品上的染料溶解出来。将得到的混合液收集起来后，用分光光度计在405 nm波长处测量其吸光度。通过将测得的吸光度值与用已知钙浓度制成的标准曲线进行对比，就可以确定样品中的钙沉积量[28]。

2.11 统计分析
所有的实验都是以三个重复组的形式进行的，实验结果以平均值±标准差（SD）的形式呈现。统计分析则是使用GraphPad Prism 9.5.1版本以及Microsoft Excel软件来完成的。当涉及三个或更多组之间的比较时，会采用单因素方差分析（ANOVA）以及Tukey多重比较检验方法来进行分析。如果P值小于0.05，则认为该差异在统计学上具有显著性意义。

3 结果与讨论
3.1 生物陶瓷的合成
磷酸钙的尺寸、形状以及成分在调控诸如hMSCs的增殖、成骨分化、生物矿化以及骨组织形成等生物过程方面起着至关重要的作用。目前，已有许多类型的磷酸钙，如HAP、β-TCP、α-TCP和BCP，被研究用于骨科领域。不过，有研究指出BCP是一种较为适合用于生物医学应用的磷酸钙，因为它能够兼顾HAP和β-TCP各自的缺点——HAP的降解速度较慢，而β-TCP的降解速度则较快；同时HAP具有较好的机械性能，而β-TCP的机械性能较差[29]。通常情况下，这些BCP是通过按适当比例混合HAP和β-TCP后再进行烧结的方式来合成的。然而，在这个过程中往往会出现HAP分解为TCP以及β-TCP转变为α-TCP之类的问题[30]。因此，有必要探索另一种合成BCP的方法。利用微波辅助湿法沉淀技术，结合钙源、磷源以及聚合物来促使ACP的生成，或许是一种可行的合成整合型BCP的方法。在本研究中，我们选用了具有钙螯合作用的乳蛋白酪蛋白作为聚合物材料，以此来螯合钙离子，并促进ACP的生成。酪蛋白分子中高度磷酸化的区域对钙离子具有很强的亲和力，能够通过其磷酸丝氨酸残基有效地结合并隔离溶液中的钙离子[31]。这样一来，就能够达到矿物核化所需的过饱和状态，ACP纳米团簇便能轻易形成，并且会被酪蛋白或其磷酸肽所稳定下来。如此一来，磷酸钙核化所需的局部过饱和条件便得以实现，进而形成了ACP纳米团簇。为验证非晶前驱相的形成，对所合成的前驱体进行了XRD分析（见补充图1）。所得XRD图谱显示，纯HAP和β-TCP在25.9°及31°-33°附近呈现出弱而宽的峰。此外，随着酪蛋白含量的增加，这些峰变得更为强烈且宽泛，表明与HAP和β-TCP相比，磷酸钙的有序性及核化程度有所提高，从而说明ACP已经形成。研究还发现，在酪蛋白存在的情况下，所合成ACP的钙磷比介于1.52到1.64之间。这一钙磷比低于HAP的化学计量值1.67，说明形成了缺钙的磷酸钙相。SEM和EDX分析进一步证实了这一现象，即在煅烧前的BCP粉末中，钙磷比也相对较低（见补充图2）。众所周知，这类缺钙的前驱体在煅烧过程中会发生相变，进而形成同时包含HAP和β-TCP两相的BCP。因此，酪蛋白在调控核化、钙离子的可用性以及晶体生长方面起着重要作用。这一过程类似于牛奶中的自然矿化现象——酪蛋白微粒可作为储存大量无定形状态下的钙和磷的载体，防止其过早结晶[32]、[33]。一旦这些微粒被钙离子和磷离子饱和，当溶液的钙磷比约为1.67时，溶液中可用的离子会促使HAP沉淀；而当钙磷比低于1.67时，则会形成缺钙的磷灰石。此外，随着酪蛋白含量的增加，钙离子和磷离子会被封存在微粒内部，导致溶液中出现缺钙环境，进而促进ACP的生成。在后续的煅烧过程中，较高的温度会使ACP发生脱水和结构重组。这种热转变会促使ACP分别结晶为HAP和β-TCP。其原理是，加热会去除水分并打破酪蛋白的稳定作用，为原本无定形的矿物提供足够能量，使其重新排列成热力学上更稳定的晶体相，如β-TCP。在800–1,000°C范围内加热ACP可使其转化为β-TCP，具体温度及最终产物相态会受到化学环境、加热速率以及是否存在改性离子或有机物等因素的影响[34]。因此，通过优化酪蛋白浓度，并采用合适的微波辅助合成及煅烧条件，可以系统地控制最终生物陶瓷材料中的双相组成，尤其是HAP和β-TCP的比例。这种可调性对于根据不同的生物医学应用需求调整生物陶瓷的性能至关重要。合成过程中的微波辅助作用能够加快反应速率并促进更均匀的核化，有研究表明微波方法有助于形成混合良好的HAP和β-TCP相[35]。通过调节酪蛋白浓度，可以控制局部化学环境和核化条件，进而影响磷酸钙的过饱和度并稳定无定形前驱体，从而进一步调整两种相的比例。之所以会出现双相结构，是因为HAP相对稳定且溶解度较低，而β-TCP则是在较高温度下由ACP和缺钙磷灰石经热转变形成的，如图2所示。3.4 润湿性分析与生物活性
通过接触角测定仪评估了包括HAP、β-TCP和BCP在内的生物陶瓷的润湿性或亲水性/疏水性。测试结果表明这些生物陶瓷具有亲水特性。HAP-Ca10(PO4)6(OH)2的接触角为19±1°，表明其表面具有高度亲水性，这很可能是因为其晶格中存在羟基（OH），能够与水分子发生强烈相互作用。而β-TCP（Ca3(PO4)2）的晶格中缺乏羟基，因此其亲水性稍弱，接触角为21.66±0.47°，不过这一数值仍属于亲水范围。β-TCP相比HAP具有更高的接触角，这可能与其不同的表面化学性质和晶体结构有关，这类结构可能导致其与水分子的氢键作用较弱，从而表现出更强的疏水性。此前有研究显示，HAP纳米片的接触角约为22.6°[43]。此外，BCP样品的润湿性会因相组成、颗粒形状及尺寸分布的不同而有所差异。0.25 BCP（18.6±1.7°）、0.5 BCP（15.5±0.5°）、1 BCP（18±3°）以及2.5 BCP（16.6±0.9°）样品的亲水性与HAP样品相近。但在酪蛋白浓度较高时，5 BCP（14.66±0.47°）和10 BCP（14.66±0.94°）的接触角显著降低，如图5(A)所示。这可能是由于在高酪蛋白浓度下发生了突发型成核，形成了细小的BCP纳米颗粒，进而影响了材料的表面能及亲水-疏水平衡。因此，在BCP合成过程中加入酪蛋白会改变最终材料的相组成、颗粒大小、形态以及表面特性，而这些因素都对所合成BCP的润湿性起着关键作用。

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图5. 所合成生物陶瓷的物理化学特性：(A) 通过接触角测量评估润湿性。(B) 与生物陶瓷共同孵育后的SBF溶液pH值变化。(C) 在SBF中浸泡14天后的生物陶瓷的SEM显微图及EDX光谱。统计显著性通过单因素方差分析确定（* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001，**** p < 0.0001）（n=3）。

通过将所合成的HAP、β-TCP和BCP生物陶瓷浸泡在模拟体液（SBF）中，评估了它们的生物活性，以此检测由于溶解-重沉淀反应、结构变化或相转变所导致的pH值变化。如图5(B)所示，生物陶瓷周围环境pH值的变化反映了其生物活性，以及其与周围环境相互作用、调控生物矿化作用及骨形成与重塑的能力。SBF中pH值随浸泡时间的变化为了解这些生物陶瓷的溶解-重沉淀行为及整体生物活性提供了重要依据。在浸泡初期（24小时内），所有样品的pH值均出现适度上升（7.6–7.8），表明表面开始发生溶解，尤其是在富含β-TCP的样品中，由于其溶解度更高，释放出了相对较多的碱性钙离子。相比之下，HAP由于结晶度高且结构稳定，其pH值上升较为缓慢且平缓[44]。当浸泡时间达到48小时时，pH值出现明显下降，这说明陶瓷表面开始有磷灰石相重新沉淀。这种早期的生物反应有助于离子释放，并促进材料表面形成类骨磷灰石层[14]、[45]。这种理想的平衡状态有助于维持表面的矿化作用，进而提升生物陶瓷在生理环境中的生物整合潜力[12]、[45]。

此外，图5(C)显示，BCP在SBF中浸泡14天后，其表面出现了类似花朵状的矿物沉积物。这些磷灰石团簇的形成表明BCP具有生物活性，能够在生理离子环境中促进磷酸钙层的生长。观察到的表面转化与矿化作用是由溶解-沉淀过程引起的。这些矿化沉积物表明形成了仿生磷灰石，进一步证实了这些生物陶瓷的生物活性[46]。EDX分析还显示，经过14天的SBF浸泡后，样品的Ca/P比率逐渐向HAP的化学计量值（Ca/P≈1.67）靠拢。具体而言，0.25BCP、0.5BCP和1BCP的Ca/P比率为1.65，而2.5BCP和5BCP的Ca/P比率为1.62。与初始缺钙的BCP配方相比，这些数值表明由于磷灰石的沉积，颗粒表面的钙和磷含量有所增加。

此外，还对浸泡后的样品进行了XRD和FT-IR分析。浸泡14天后，XRD分析显示，与BCP相关的HAP特征峰变得更加明显，其强度从0.25 BCP逐渐增加到10 BCP。而与BCP相关的β-TCP峰的相对强度则逐渐减弱。这表明在浸泡过程中发生了原位相转变。具体来说，β-TCP随着时间的推移逐渐转变为HAP。这种转变可归因于与SBF环境中的离子交换所促成的溶解-重沉淀机制[47]。半定量相分析进一步证实了这一转变，经SBF处理后，HAP/β-TCP比率逐渐上升。如图6(A)和6(B)所示，0.25BCP的HAP与TCP比例约为90%:10%，0.5BCP约为91:9，1BCP约为87:13，2.5BCP约为74:26，5BCP约为61:39，10BCP约为65:35。这些研究结果表明，SBF浸泡不仅引发了离子交换和溶解-重沉淀过程，还改变了BCP的相组成。SBF处理会导致形成以HAP为主的材料，这一现象已被证明有助于促进新骨组织基质的沉积及移植物与组织的整合。CVR Truite等人报道，经过28天的SBF浸泡后，BCP基材表面会沉积磷灰石层，其Ca/P比率接近HAP的化学计量值，这进一步证实了β-TCP含量的减少以及生物活性的提升[14]。同样，C d’Arros等人也证明了BCP表面会沉积磷灰石层，而这与材料的生物活性及成骨导导性能直接相关[12]。这些研究结果都表明，本研究中观察到的SBF处理后的相变与已知的离子交换、溶解-重沉淀过程以及表面重构机制一致，而这些机制正是BCP生物材料具备优异生物性能的基础[48]。

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图6. 物理化学特性分析：(A) SBF浸泡后生物陶瓷的XRD图谱。(B) SBF浸泡后生物陶瓷的定量相浓度分析。(C) 相应SBF浸泡后生物陶瓷的傅里叶变换红外（FTIR）光谱。

此外，还通过FTIR分析评估了BCP在SBF中浸泡后的化学变化及相演变情况。浸泡14天后，FTIR光谱显示出与HAP相关的磷酸根（PO43-）和羟基（OH-）振动峰强度显著增强，而与β-TCP相关的峰则逐渐减弱并向HAP的磷酸根峰方向移动。这种转变可归因于在SBF介质中，更易溶的β-TCP相优先发生溶解，从而导致表面重新沉淀出磷灰石层。此外，约1000–1100 cm-1区域的磷酸根伸缩峰变宽，进一步证实了生物陶瓷内部发生了结构重排，如图6(C)所示。这些变化反映了SBF环境中存在的动态离子交换与溶解-重沉淀机制。由于BCP与SBF之间的表面反应，使得环境呈碱性，而pH值的逐渐上升又有利于释放出的钙和磷酸根离子在陶瓷表面重新沉淀为磷灰石层。流体中钙和磷酸根的局部过饱和状态促进了HAP的成核与生长，从而使XRD图谱中HAP相的强度上升[49]。因此，SBF浸泡不仅能模拟生理环境，还能激活BCP材料的生物反应性，促进离子释放，进而增强生物矿化作用及骨组织重建。

3.5 凝血试验
根据ASTM F756-00标准，通过凝血试验评估了所合成生物陶瓷的血液相容性[50]。如图7(A)所示，96孔板中出现了明显的颜色变化，从深红色（表示完全凝血）到淡黄色或透明孔（表示几乎无凝血或无凝血现象）。通过对血红蛋白释放量的定量分析，发现不同测试样品的凝血活性存在差异。HAP、0.25BCP、0.5BCP、1BCP、2.5BCP和β-TCP的凝血率分别为0.85±0.09%、0.144±0.045%、0.42±0.04%、0.152±0.09%、0.68±0.17%和0.623±0.053%，均低于5%的非凝血材料阈值，说明这些材料具有良好的血液相容性。5BCP和10BCP的凝血率略高，分别为1.97±0.08%和1.39±0.17%。尽管这一数值高于其他测试组，但仍远低于5%的细胞毒性阈值，因此不存在有害的凝血效应。阳性对照组的凝血率为100%，而阴性对照组PBS的凝血率则低于0.1%，这进一步证明了该试验的可靠性与灵敏度。Marimuthu等人报告称，BCP的凝血率在1.8%至1.95%之间，始终低于ASTM和ISO标准规定的5%阈值，因此认为其可用于生物医学领域[22]。同样，Barbosa等人也发现，HAP/TCP复合材料及纯HAP的凝血率在1.3%至2.3%之间，远低于细胞毒性阈值，因此被归类为非凝血材料，适合用于与血液接触的应用场景[22]。Ooi等人进一步证实，纳米多孔HAP材料的凝血率低于5%，这体现了其出色的血液相容性及其临床应用潜力[51]。这些对比研究结果均表明，包括各种HAP、β-TCP和BCP组合在内的生物陶瓷的凝血率均远低于安全临界值，且其试验结果与以Triton X-100作为阳性对照、PBS作为阴性对照所获得的可靠数据一致。这些结果证实，所有受测生物陶瓷样品，包括5BCP和10BCP，均不具备凝血性，适合用于潜在的生物医学应用。

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图7. 所合成生物陶瓷的体外生物相容性评价：(A) 凝血试验结果，用于评估生物陶瓷的血液相容性。(B) MTT试验结果，显示第1天、第3天和第7天的细胞存活率。(C) AO/PI荧光试验结果，显示第7天的细胞黏附情况与细胞毒性。统计显著性通过单因素方差分析确定（* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001，**** p < 0.0001）（n=3）。

3.6 代谢活性与吖啶橙/碘化丙啶染色试验
如图7(B)所示，通过MTT试验评估了经nHAP、β-TCP和BCP生物陶瓷提取物处理的间充质干细胞（hMSCs）的存活情况。测试结果表明，这些生物陶瓷具有良好的细胞相容性，且能够促进细胞增殖。值得注意的是，含有纯HAP、BCP（0.25% BCP）和β-TCP的实验组中，细胞的存活率均高于对照组，且随着时间推移存活率百分比逐渐上升。细胞存活率极易受到局部pH值变化以及离子微环境的影响，而这些又与生物陶瓷的溶解以及过饱和离子的重新沉淀密切相关。此外，β-TCP的溶解速度比BCP快，而BCP的溶解速度又比HAP快（β-TCP>BCP>HAP）[52]。β-TCP更快溶解并使溶液饱和，随后离子会以稳定的磷灰石层形式在剩余的β-TCP表面重新沉淀，从而为细胞生长提供有利的离子微环境。另外，0.25-2.5比例的BCP具有较为平衡的溶解-重新沉淀过程：β-TCP相的溶解会释放出离子，而HAP相则有助于磷灰石的成核与重新沉淀，进而维持有利于细胞生长的最佳离子微环境。相比之下，HAP是一种稳定性极高的生物陶瓷，其溶解产生的离子数量有限，因此相比β-TCP和0.25BCP，其支持细胞生长的能力相对较弱。然而，与HAP、0.25–2.5比例的BCP以及β-TCP相比，含有其他比例BCP（0.5–10 BCP）的培养环境中细胞生长速率虽较低，但仍高于对照组。这可能是由于生物陶瓷颗粒分布不均，且较高比例的β-TCP会导致溶解-重新沉淀过程出现异常，无法为细胞生长创造有利的离子环境。因此，观察到了这样的细胞存活率规律：β-TCP组的存活率最高，BCP组次之，HAP组最低，这一结果与先前研究得出的β-TCP>BCP>HAP的存活率顺序一致[53]。在不同提取浓度下细胞存活率均呈现持续上升的趋势，这说明接触这些生物材料不仅能避免细胞毒性作用，还能为间充质干细胞附着和增殖创造有利条件。因此，HAP/β-TCP比例较高的BCP配方因其能够长期支持间充质干细胞的生长与存活，被视为骨组织工程领域的理想基质。此外，如图7(C)所示，第7天时还通过AO/PI染色试验评估了经生物陶瓷提取物处理的细胞的存活情况，荧光显微镜图像也反映了这一结果。在所有类型的生物陶瓷处理组中，绿色染色的活细胞占比极高，红色染色的死细胞极少，这说明这些材料具有良好的细胞相容性。研究结果表明，所合成的HAP、BCP和β-TCP都具有细胞相容性，能够支持细胞生长。同时，形态学观察显示不同陶瓷成分会导致细胞形态存在明显差异：用纯HAP提取物培养的细胞多呈纺锤形，球形细胞较少；而经β-TCP处理的细胞则更接近球形，长形细胞较少。此外，β-TCP含量较低的BCP处理组细胞呈现更长的形态，而β-TCP含量较高的BCP处理组细胞则更接近球形。细胞形态的这种差异可能源于β-TCP更强的生物活性，它会改变周围环境的pH值及Ca2+/PO43-离子浓度，进而导致细胞初期出现应激反应，影响细胞的黏附功能。但随着时间推移，钙和磷的重新沉淀促进了HAP的沉积，为细胞生长和分化创造了理想环境。有趣的是，在β-TCP含量较高的BCP处理组中，细胞分布更为广泛，且肌动蛋白丝和细胞间连接结构更为清晰，这说明细胞与基质的相互作用更强，具备更好的成骨潜力[48]。细胞扩散程度和密度的逐步增加表明，这种双相结构能够在HAP的化学稳定性和β-TCP的离子反应性之间实现良好平衡，从而促进细胞更好地附着、增殖并发挥生物活性[54]、[55]、[56]。使用ImageJ软件从AO/PI荧光图像中定量分析了活细胞和死细胞的占比，相关结果已收录在补充信息中（补充图3）。

3.7 碱性磷酸酶活性与生物矿化

碱性磷酸酶是细胞经生物陶瓷提取物处理后发生成骨分化过程中的重要早期至中期标志物。这是一种能够催化各种底物上磷酸基团水解的酶，其活性是成骨细胞开始发生成骨分化及生物矿化的关键指标[27]。我们在第7天、第14天和第21天分别检测了不同生物陶瓷提取物组（HAP、BCP和β-TCP）、成骨培养基组以及对照组中的碱性磷酸酶活性。研究发现，生物陶瓷提取物对碱性磷酸酶活性的提升作用显著优于成骨培养基。在第7天时，0.5BCP和1BCP处理组的碱性磷酸酶活性就高于其他组。不过到第14天时，所有样本的碱性磷酸酶活性都逐渐上升，各生物陶瓷提取物组之间的差异并不明显。到第21天时，大多数生物陶瓷提取物组的碱性磷酸酶活性都有显著提升，甚至超过了成骨培养基组和对照组，这表明成骨成熟和基质矿化过程仍在持续且十分活跃。统计分析显示，到第21天时，多个BCP提取物组的碱性磷酸酶活性显著高于对照组，甚至高于成骨培养基组，详见图8(A)。

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图8. 所合成材料的体外成骨性能评价。(A) 在第7天、第14天和第21天进行碱性磷酸酶活性检测，以评估间充质干细胞在生物陶瓷样品上的早期成骨诱导效果。(B) 在第7天、第14天和第21天进行茜素红染色，以评估钙矿化程度及成骨分化情况。(C) 通过十六烷基吡啶氯化物检测法对矿物沉积量进行定量分析。统计显著性通过单因素方差分析确定（* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001，**** p < 0.0001）(n=3)。

如图8(B)所示，茜素红染色结果反映了在21天时间里，用不同生物陶瓷提取物（HAP、BCP和β-TCP）处理的细胞所发生的细胞外生物矿化进程。第7天时，所有实验组几乎都没有明显的茜素红染色，说明此时尚未出现显著的钙沉积，细胞也处于成骨分化的早期阶段。到第14天时，部分组别，尤其是HAP组、1BCP组和2.5BCP组，出现了零星的红色染色区域，这表明成骨细胞开始沉积富含钙的细胞外基质成分，矿化过程已经开始。尽管此时染色强度和范围仍较为有限，但可以观察到基质正在逐步成熟。到第21天时，所有生物陶瓷提取物组的茜素红染色强度都有显著提升，说明钙矿化已经十分广泛。这些结果证实，无论成分如何，所有受试的生物陶瓷提取物都能为成骨分化及基质矿化创造有利的环境。不过，含HAP或HAP比例较高的BCP组比含β-TCP或β-TCP比例较高的BCP组更早出现成骨分化现象。这可能是因为前者能形成更稳定的黏附结构，且整合素介导的信号传导更有助于成骨分化。而BCP中的β-TCP相则会改变局部pH值和离子组成，从而在早期阶段阻碍细胞的黏附、形态形成以及成骨分化。与茜素红染色结果一致，图8(C)中的CPC检测结果显示，在早期阶段（第7天）吸光度值较低，说明此时基质矿化程度有限。到第14天时，部分样本的吸光度略有上升，反映出初步的成骨活性和钙沉积现象。第21天时，各生物陶瓷提取物的吸光度值均高于成骨培养基对照组，进一步证明生物陶瓷提取物能够促进矿化作用。具体而言，各组的吸光度值（平均值±标准差）如下：HAP提取物为1.799 ± 0.06；0.25BCP为2.13 ± 0.02；0.5BCP为2.19 ± 0.01；1BCP为2.29 ± 0.04；2.5BCP为2.46 ± 0.10；5BCP为1.74 ± 0.02；10BCP为1.89 ± 0.03；β-TCP为1.90 ± 0.01。其中2.5BCP提取物的矿化程度最高，1BCP和0.5BCP提取物紧随其后，这说明中等比例的BCP更能有效促进后期的成骨分化并推动矿物沉积。总体而言，这些研究结果进一步证明了生物陶瓷提取物具有成骨诱导潜力，且其促进钙基质形成的能力优于常规的成骨条件。

4. 结论

通过一步湿法沉淀法，我们成功合成了HAP与β-TCP比例可调控的生物活性BCP陶瓷材料。结构分析和物相分析证实了HAP和β-TCP共存于这些材料中。此外，通过调整酪蛋白介导的ACP饱和胶束的形成程度，还可以调控HAP/β-TCP的相对比例。XRD分析结果显示，不同成分的这些材料均具有双相结构，且结晶度存在差异；FTIR光谱则检测到了特征性的磷酸根和羟基振动峰，进一步证实了钙磷相的形成。形态学观察显示，纯HAP中的颗粒呈长条状，而BCP样品中的颗粒则为粗糙的多边形结构，后者更有利于离子交换和细胞生长。当这些BCP样品浸入模拟体液后，会表现出明显的溶解-重新沉淀行为，表现为表面形成磷灰石层，同时Ca2+和PO43-离子浓度也会出现可控的波动。与含HAP较多的陶瓷材料相比，含β-TCP较多的材料由于其溶解度更高，pH值上升速度更快，但随着表面磷灰石的重新沉淀，pH值又会趋于稳定，因此其生物活性更为优异。体外细胞相容性试验进一步验证了这些合成BCP材料的生物学性能：MTT试验证实了细胞的存活率和增殖能力，尤其是那些含有中等比例β-TCP的材料；吖啶橙染色则显示了密集且处于活跃增殖状态的细胞群；碱性磷酸酶活性则表明细胞已开始出现早期成骨分化现象。综合来看，这些研究结果表明，经过优化的双相结构能够在HAP的化学稳定性和β-TCP的生物可降解性之间实现协同平衡，从而进一步提升材料的生物活性和成骨潜力。

作者贡献说明

Shyamasundar N Bhat：撰写——审阅与编辑。
Prathap Somu：撰写——审阅与编辑，资源收集。
Ajeetkumar Patil：撰写——审阅与编辑，资源收集。
Bhisham Narayan Singh：撰写——审阅与编辑，项目监督，项目管理，实验实施，概念设计。
Ankitha Suresh：撰写——初稿撰写，数据可视化，结果验证，方法设计，实验实施，正式分析，数据整理。
Varsha Pai：正式分析。
Atharva Kenkre：正式分析。
Bhavana Anchan：正式分析。
Himansu Sekhar Nanda：撰写——审阅与编辑。
Kamalesh Mumberkar：撰写——审阅与编辑

利益冲突声明

作者声明不存在任何利益冲突。专利申请编号：202441023721（已获批）

数据可用性

本研究获得的数据已收录在本篇文章中，如需获取可向相应作者索取。

人工智能使用声明

在论文撰写过程中，仅使用了人工智能技术来对句子进行改写和语言优化。

资金支持声明

本研究得到了DBT的资助（资助编号：BT/PR50614/MED/32/984/2023）。