息风止抽汤通过调节神经炎症和神经递质稳态减轻幼年大鼠抽动障碍：Nr4a2与肠道菌群的双重调节

《Chinese Medicine》：Xifeng Zhichou decoction mitigates tic disorder on juvenile rats by regulating neuroinflammation and neurotransmitter homeostasis: dual modulation of Nr4a2 and gut microbiota

　　

背景：息风止抽汤（XFZCD）是一种改良的中药方剂，在治疗抽动障碍（TD）中显示出显著的临床疗效。然而，其疗效和治疗机制仍未被充分阐明。目的：本研究旨在全面评估XFZCD在大鼠模型中的抗TD效果，并阐明其潜在机制。方法：采用超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS）对XFZCD进行质量分析，同时利用网络药理学预测核心化合物和潜在机制。通过腹腔注射3,3-亚氨基二丙腈建立幼年TD大鼠模型，并使用行为学测试、细胞因子检测和免疫组织化学评估XFZCD的治疗效果。研究人员采用转录组学和16S rRNA测序，通过研究调控基因和肠脑轴来阐明机制。利用蛋白质印迹（WB）和酶联免疫吸附试验聚焦并验证潜在机制。进行非靶向代谢组学，从末端代谢物的角度确认关键通路。此外，研究人员在脂多糖（LPS）刺激的SH-SY5Y细胞中进行Nr4a靶向的siRNA敲低，以验证Nr4a2在XFZCD介导的神经保护中的核心调控作用。结果：UPLC-MS分析鉴定出XFZCD中的66种化合物。网络药理学在富集分析中强调了血清素能突触、多巴胺能突触和JAK-STAT信号通路，提示XFZCD通过调节神经炎症和神经递质稳态治疗TD。XFZCD显著减轻了大鼠模型的抽动、异常运动行为和厌食，同时减轻了纹状体神经炎症和氧化应激，从而对TD表现出显著的治疗效果。转录组分析将Nr4a2鉴定为关键调控基因，该基因与通过网络药理学鉴定的核心成分表现出强结合亲和力。16S rRNA测序显示，XFZCD通过恢复厚壁菌门/拟杆菌门比率来调节肠道功能。WB和ELISA实验证实，XFZCD可抑制炎症反应并恢复中枢神经递质稳态。非靶向代谢组学表明，XFZCD逆转了TD引起的异常胆汁酸代谢，这与肠道微生物重塑密切相关。细胞实验证实，Nr4a2沉默在很大程度上消除了XFZCD对神经炎症的抑制作用及其对神经递质平衡的调节功能。结论：XFZCD通过双重调节Nr4a2和肠道菌群抑制炎症并平衡神经递质，从而在治疗TD中显示出显著疗效。值得注意的是，对Nr4a2和胆汁酸代谢的调节成为治疗TD的一条有前景的治疗途径。

**论文解读：息风止抽汤通过Nr4a2与肠道菌群双重调节治疗抽动障碍的机制研究**

**研究背景**

抽动障碍（tic disorder, TD）是一种好发于儿童的复杂神经发育障碍，我国6-16岁学龄儿童患病率约为2.46%。患者常表现为突然、快速、重复、刻板的运动抽动和/或发声抽动，导致学业、社交及心理问题，严重影响患儿及家庭的生活质量。目前临床常用的α₂-肾上腺素能受体激动剂和抗精神病药物存在体重增加、嗜睡、锥体外系症状及代谢异常等副作用，临床应用受限。因此，亟需开发安全有效的药物治疗方案。根据中医理论，TD的发病与肝风内动密切相关，平肝熄风治法在临床中展现出良好疗效且不良反应轻微。息风止抽汤（Xifeng Zhichou Decoction, XFZCD）是深圳市儿童医院基于经典方剂改良的经验方，在临床中显著降低TD患儿抽动频率并改善耶鲁综合抽动严重程度量表（Yale Global Tic Severity Scale, YGTSS）评分，但其系统研究不足、机制不清，阻碍了标准化推广。本研究旨在全面评估XFZCD的抗TD效果并阐明其分子机制，为其中医临床应用提供科学依据。该论文发表在《Chinese Medicine》。

**主要技术方法**

研究人员采用超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS）定性分析XFZCD化学成分；通过网络药理学预测核心活性成分及潜在靶点通路；以3,3-亚氨基二丙腈（IDPN）腹腔注射建立幼年Sprague-Dawley大鼠（出生后21-23天，体重50-70g，购自广东维通利华实验动物技术有限公司）TD模型；通过行为学测试（旷场实验、运动及刻板行为评分）、酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫组织化学评估疗效；采用转录组学（Illumina测序，由百迈克生物技术有限公司执行）和16S rRNA基因测序（由北京百迈客生物科技有限公司执行）探究纹状体基因表达及肠道菌群变化；利用蛋白质印迹（WB）和ELISA验证神经炎症与神经递质通路；通过非靶向代谢组学（UPLC-Q/TOF MS）分析血清代谢物；并在脂多糖（LPS）刺激的SH-SY5Y细胞中进行Nr4a2 siRNA敲低以验证核心调控作用。

**研究结果**

**Chemical analysis of XFZCD（XFZCD的化学成分分析）**
通过UPLC-MS在正负离子模式下鉴定出XFZCD中66种化合物，主要为酚酸及其苷类、环烯醚萜类、黄酮类、芍药苷类等，来源多归于远志、地黄、白芍、郁金、天麻等药材。

**Key components and possible targets of XFZCD for TD treatment（XFZCD治疗TD的关键成分与潜在靶点）**
网络药理学构建“草药-成分-靶点”网络，筛选出20个核心化合物；交集74个TD相关靶点；蛋白互作网络（PPI）突出AKT1、TNF、STAT3等关键节点；基因本体（GO）富集分析显示多巴胺代谢、核受体活性、神经递质调节；京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集提示血清素能突触、多巴胺能突触及JAK-STAT信号通路参与，表明XFZCD可能通过调节神经递质稳态和神经炎症发挥抗TD作用。

**XFZCD improved behavioral indicators of TD rats（XFZCD改善TD大鼠行为学指标）**
模型组（MOD）大鼠体重增长减缓、摄食饮水减少，旷场实验中总移动距离、中央区停留时间及平均速度显著增加，运动及刻板行为评分升高。XFZCD中、高剂量（MZD、HZD）显著增加体重、改善摄食，降低中心区时间和平均速度，高剂量组总移动距离显著减少，且运动与刻板行为评分显著下降，效果与阳性药泰必利（TIA）相当。

**XFZCD attenuated neuroinflammation, oxidative stress, and microglial activation in TD rats（XFZCD减轻TD大鼠神经炎症、氧化应激及小胶质细胞激活）**
ELISA检测显示MOD组纹状体肿瘤坏死因子α（TNFα）和白细胞介素6（IL-6）显著升高，谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）和超氧化物歧化酶（SOD）活性下降，丙二醛（MDA）水平升高。XFZCD呈剂量依赖性地降低促炎因子、恢复抗氧化酶活性、降低MDA。免疫组化显示MOD组小胶质细胞呈阿米巴样激活，IBA1阳性面积增加；XFZCD和TIA可逆转小胶质细胞过度激活，减轻形态学改变。

**XFZCD regulated gene expression in TD rats（XFZCD调节TD大鼠基因表达）**
转录组学分析筛选出22个共同差异表达基因（DEGs），KEGG富集于神经保护与神经炎症相关通路（如配体-受体相互作用）。其中Nr4a2（核受体相关因子1，Nurr1）变化最显著：MOD组表达显著下调，高剂量XFZCD（HZD）恢复至正常水平。分子对接显示核心成分（芍药苷、芍药内酯苷、巴利森苷A、去甲淫羊藿素）与Nr4a2结合能介于-5.6至-8.0 kcal/mol，验证了直接靶向作用。

**XFZCD altered the structure and diversity of gut microbiota（XFZCD改变肠道菌群结构与多样性）**
16S rRNA测序显示MOD组Shannon指数改变，β多样性分析（UPGMA聚类）显示MOD组与对照组分离，而HZD组接近对照组。门水平：MOD组厚壁菌门（Firmicutes）减少、拟杆菌门（Bacteroidetes）增加，XFZCD部分恢复其比率。属水平：MOD组Ligilactobacillus、Bifidobacterium和Romboutsia丰度降低，XFZCD干预后升高。功能预测提示氨基酸代谢与次级代谢产物合成通路变化。Spearman相关分析显示，这些菌属与促炎因子（TNFα、IL-6）及谷氨酸（Glu）呈负相关，与多巴胺（DA）、5-羟色胺（5-HT）、γ-氨基丁酸（GABA）呈正相关。

**XFZCD rectifies systemic metabolic disturbances（XFZCD纠正全身代谢紊乱）**
非靶向代谢组学主成分分析（PCA）显示MOD组与对照组和HZD组分离。筛选出42种差异代谢物，主要涉及胆汁酸及其衍生物（如牛磺熊去氧胆酸TUDCA、硫酸石胆酸、猪去氧胆酸、熊去氧胆酸3-硫酸等）。MOD组血清TUDCA显著降低，其他7种胆汁酸升高；XFZCD干预后恢复至正常水平。Spearman相关分析显示Romboutsia、Ligilactobacillus、Bifidobacterium等菌属与多数胆汁酸衍生物呈负相关，而Akkermansia和Dubosiella呈正相关。

**XFZCD restores neurotransmitter homeostasis and neuroinflammation（XFZCD恢复神经递质稳态与神经炎症）**
皮质神经递质检测显示MOD组DA、5-HT、GABA降低，Glu升高；XFZCD显著逆转这些变化。纹状体WB检测显示MOD组Nr4a2表达下降，磷酸化JAK1升高；高剂量XFZCD上调Nr4a2和IκBα，抑制NFκB和JAK1磷酸化，从而减轻炎症信号通路激活。

**Nr4a2 knockdown blocked the anti-TD effect of XFZCD（Nr4a2敲低阻断XFZCD的抗TD效应）**
在LPS刺激的SH-SY5Y细胞中，XFZCD含药血清上调Nr4a2、抑制NFκB/JAK-STAT通路过度激活。Nr4a2 siRNA敲低后，XFZCD的上述保护作用显著减弱，IκBα表达降低，NFκB、JAK1、STAT3磷酸化增强，且DA、Glu等神经递质的调节作用消失，表明Nr4a2是XFZCD抗炎和恢复神经递质稳态的必要中介。

**讨论与结论**

**讨论**
XFZCD通过中枢和外周双重途径发挥综合治疗作用。中枢层面，XFZCD抑制纹状体小胶质细胞激活、减轻神经炎症和氧化应激，恢复DA、5-HT、GABA、Glu平衡。分子机制上，Nr4a2作为关键靶点，在生理条件下抑制NFκB活性并招募CoREST复合物清除NFκB-p65，减少促炎因子表达；TD大鼠Nr4a2下调导致NFκB/JAK-STAT通路过度激活，XFZCD通过上调Nr4a2逆转该病理过程。细胞敲低实验证实Nr4a2是XFZCD抗炎和恢复DA功能的核心调控因子。外周层面，XFZCD重塑肠道菌群（恢复厚壁菌门/拟杆菌门比率，富集Ligilactobacillus、Bifidobacterium、Romboutsia等有益菌），纠正胆汁酸代谢紊乱（升高TUDCA、降低异常胆汁酸衍生物）。TUDCA可穿越血脑屏障抑制小胶质细胞过度激活，减轻Glu兴奋毒性。Spearman分析证实菌群变化与炎症因子、神经递质及胆汁酸水平显著相关。综上，Nr4a2介导的中枢神经炎症抑制与神经递质平衡，联合肠道菌群介导的外周代谢调节，构成XFZCD治疗TD的双重机制。研究局限性包括：仅检测组织匀浆总神经递质而未分析突触间隙动态释放；未建立肠道菌群与疗效的因果关系（需粪菌移植或抗生素清除实验）；机制基于动物模型和细胞实验，需进一步临床试验验证转化潜力。

**结论**
本研究说明XFZCD在减轻TD症状方面显示出显著的治疗效果。其潜在机制与Nr4a2和肠道菌群共同调节的神经炎症和神经递质平衡密切相关。值得注意的是，Nr4a2在减轻炎症和增强多巴胺能活性方面的双重调节功能凸显了其作为管理TD的有前景的治疗靶点的潜力。