叉头盒与NF-κB海马单核RNA测序谱区分抗Drebrin和抗GAD65阳性脑炎

《Journal of Neuroinflammation》：Forkhead box versus NF-κB hippocampal snRNA-seq profiles distinguish anti-Drebrin- and anti-GAD65-positive encephalitis

　　

背景与目的：针对细胞内蛋白（包括谷氨酸脱羧酶65（anti-GAD65））的自身抗体（ABs）在自身免疫性和边缘叶脑炎（AE/LE）中日益被认识。抗GAD65 LE常进展为严重颞叶癫痫（TLE），神经病理学上以海马硬化（HS）和细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）的变异浸润为特征。近期，研究人员在疑似AE的索引患者中鉴定出Drebrin（DBN）为一种新的细胞内靶蛋白抗体。本研究旨在表征抗GAD65阳性TLE（GAD65-TLE）与抗DBN阳性TLE（DBN-TLE）患者海马组织的关键分子和细胞特征，并将其与临床参数相关联。方法：研究人员检查了海马神经病理学，并对DBN-TLE和GAD65-TLE患者的海马组织进行了探索性单核RNA测序（snRNA-seq），同时整合了来自大型患者队列的关键临床数据。结果：尽管两组患者的海马在神经病理学上几乎无法区分，但探索性snRNA-seq揭示了不同的转录程序。DBN-TLE患者（n=2）显示富集叉头盒（Fox）转录因子家族的转录特征，而GAD65-TLE患者（n=2）显示富集与NF-κB信号通路相关的转录本。在更大队列中，DBN-TLE患者（n=22）显示出比GAD65-TLE患者（n=35）显著更有利的药理学反应性，后者大部分为药物难治性。值得注意的是，在T细胞介导的LE小鼠模型中，类似的炎症程序被动态调控。结论：这些发现为罕见的自身免疫海马组织提供了基于发现的转录组特征，揭示了尽管两组患者的海马病理几乎无法区分，但抗DBN与抗GAD65阳性AE/TLE患者存在不同的免疫相关转录状态，并支持进一步研究疾病特异性治疗策略。

**研究背景与问题**
自身免疫性脑炎（AE）常累及边缘结构，导致颞叶癫痫（TLE），其中抗谷氨酸脱羧酶65（anti-GAD65）抗体是最常见的细胞内蛋白抗体之一。抗GAD65阳性TLE（GAD65-TLE）常进展为严重TLE，伴有海马硬化（HS）和细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）浸润，但临床参数与抗体滴度相关性差，且GAD65抗体的致病性存在争议。近期，研究人员发现抗Drebrin（anti-DBN）抗体与以癫痫和神经精神障碍为特征的临床综合征相关，但针对DBN-TLE的分子机制研究缺乏。由于两种抗体阳性TLE患者在神经病理学上难以区分，研究人员旨在探究其潜在的转录组差异，并关联临床参数（如药物反应），以明确是否存在不同的炎症信号通路。
**研究内容与结论**
本研究通过整合罕见海马组织样本的神经病理学评估、探索性单核RNA测序（snRNA-seq）以及来自大样本队列的临床数据，揭示了抗DBN-与抗GAD65阳性TLE患者之间截然不同的免疫相关转录程序。尽管两组患者的海马组织在细胞病理学（如HS、CTL和微胶质细胞浸润）上几乎相同，但snRNA-seq显示DBN-TLE患者富集叉头盒（Fox）转录因子家族信号，而GAD65-TLE患者富集NF-κB信号通路。在更大临床队列中，DBN-TLE患者对抗癫痫药物（ASM）的反应显著优于GAD65-TLE患者（42% vs 80%药物难治性），且免疫治疗（IT）后DBN-TLE组达到无癫痫发作的比例更高（40% vs 10%）。此外，在CD8⁺ T细胞介导的LE小鼠模型中，NF-κB相关炎症程序在急性期显著激活，与人类GAD65-TLE的转录特征部分重叠。这些发现为开发疾病特异性治疗策略提供了转录组学依据。
**关键技术方法**
研究人员使用来自德国波恩大学医院癫痫科手术切除的罕见海马组织样本，包括2例DBN-TLE、2例GAD65-TLE、2例海马硬化（HS）和2例病灶相关癫痫（LA）对照。通过单核RNA测序（snRNA-seq）对新鲜冷冻组织进行DAPI染色分选后的细胞核进行测序，结合主成分分析（PCA）和t分布随机邻域嵌入（tSNE）进行聚类和差异表达分析。同时，采用OVA-CD8⁺ LE小鼠模型（转基因OT-I/Rag1^-/-小鼠，通过rAAV-hSyn-OVA-mCherry在海马神经元中表达卵清蛋白）进行bulk RNA-seq，以对比急性炎症程序。
**研究结果**
**cMRI indicate fundamental involvement of limbic structures in DBN- and GAD65-TLE**
通过脑磁共振成像（cMRI）分析，发现DBN-TLE和GAD65-TLE患者均显示杏仁核肿胀、海马内部结构严重丧失或萎缩，两组间无显著神经影像学差异。
**HS and T cell infiltrates - neuropathological hallmarks of anti-DBN- and anti-GAD65-positive hippocampal biopsies**
苏木精-伊红（H&E）和免疫组化染色显示，两组患者均出现CA1/CA3/4区域节段性神经元丢失、颗粒细胞分散、反应性星形胶质细胞增生，以及大量先天性（CD68⁺、Iba1⁺）和适应性免疫细胞（CD3⁺、CD8⁺ CTLs）浸润，但颗粒酶B（GZMB）几乎缺失，提示慢性病程。
**Single-nucleus RNA sequencing-based cell subtype cluster identification in brain biopsies from pharmacoresistant DBN- and GAD65-TLE patients**
通过snRNA-seq对8例患者海马组织（每组2例）进行细胞分型，经过PCA、UMAP和tSNE聚类，共鉴定出14个细胞簇，包括少突胶质细胞、星形胶质细胞、免疫细胞（簇5、6、7、12）和神经元。其中免疫细胞簇通过Jaccard系数与公开单细胞数据比对，确定簇5主要为微胶质细胞，簇12为T细胞，簇6和7为混合免疫细胞群。
**Adaptive and innate immune cell abundance in hippocampi of patients with GAD65- and DBN-TLE**
与对照组相比，两种抗体阳性TLE患者的海马中免疫细胞比例更高，尤其T细胞（CD8A和CD8B表达升高）更丰富；但CD4、CD3E、GZMB、PRF1、PDCD1、CTLA4及IFNG表达无显著差异，提示慢性阶段缺乏强烈的干扰素信号和细胞毒性效应。
**Immune pathway related transcript signatures in patients with GAD65- and DBN-TLE**
对免疫簇5、6的差异表达基因（DEGs）进行基因本体（GO）分析，发现GAD65-TLE患者显著富集NF-κB、肿瘤坏死因子（TNF）、NOD样受体、HIF-1、Toll样受体信号通路及Th17细胞分化；而DBN-TLE患者富集叉头盒O（FoxO）和趋化因子信号通路、补体与凝血级联反应及FcγR介导的吞噬作用。
**Differential transcription factor enrichment in hippocampal mRNA of GAD65- versus DBN-TLE patients**
转录因子富集分析（TFEA）显示，GAD65-TLE中NF-κB通路转录因子（REL、RELB、NFKB2）显著富集，而DBN-TLE中Fox家族转录因子（FOXO1、FOXN2、FOXN3）显著富集。目标基因热图进一步证实两组间REL/RELB和FOXO1/FOXN2靶基因的差异性表达模式。
**Distinct therapy responses between DBN- and GAD65-TLE patients**
在更大队列中，42%的DBN-TLE患者对ASM药物难治，而GAD65-TLE组为80%（Fisher精确检验p=0.0081）。免疫治疗后，DBN-TLE组40%患者达到无癫痫发作，而GAD65-TLE组仅10%。
**Distinct pharmaco-response potentials indicated by anti-GAD65 and anti-DBN hippocampal RNA signatures**
通过药物-基因相互作用数据库（DGIdb）和LINCS L1000计算分析，预测糖皮质激素（如泼尼松、地塞米松）可抑制NF-κB通路靶基因，而抗氧化剂（如白藜芦醇）和GLP-1受体激动剂可能调节FoxO和NF-κB信号，但仅为假设生成。
**mRNA signatures of a T cell-driven mouse model of limbic encephalitis**
在OVA-CD8⁺ LE小鼠模型中，注射rAAV-OVA后第5天（急性期）的bulk RNA-seq显示大量DEGs（1132个上调），GO和KEGG分析富集NF-κB、TNF、NOD样受体、Toll样受体通路及Th1/Th2/Th17分化。TFEA进一步发现STAT家族、HIF1A、NF-κB（REL、RELA）及部分Fox基因（FOXO1、FOXP3）的富集，与人类GAD65-TLE的特征重叠。
**讨论与结论**
讨论部分指出，CTL在早期疾病阶段可能驱动神经元损伤，但慢性阶段微胶质细胞成为主要免疫群体，其转录状态差异（FoxO vs NF-κB）可能受抗原靶点、抗体特性、遗传因素及微环境细胞因子影响。NF-κB信号在GAD65-TLE中与促炎活化相关，而FoxO信号在DBN-TLE中可能参与应激抵抗和稳态维持。这些差异可能解释临床药物反应的不同，但需在更大队列中验证。研究局限性包括样本量小、组间年龄和病程差异、治疗史混杂等，因此结果应视为探索性和假设生成。
**研究结论**：这些发现为罕见的自身免疫海马组织提供了基于发现的转录组特征，揭示了尽管两组患者的海马病理几乎无法区分，但抗DBN-与抗GAD65阳性AE/TLE患者存在不同的免疫相关转录状态，并支持进一步研究疾病特异性治疗策略。