通过转录组RNA-seq技术评估炎症相关信号通路在大鼠呼吸机诱导的膈肌功能障碍中的作用

《BMC Molecular and Cell Biology》：Assessment of the role of inflammation-linked signaling pathways in ventilator-induced diaphragmatic dysfunction in rats by transcriptome RNA-seq

　　

摘要

目的

研究大鼠机械通气引起的膈肌功能障碍（VIDD）发病机制中的关键基因及炎症信号通路，旨在寻找潜在的治疗靶点。

方法

成年雄性Wistar大鼠被随机分为对照组（0小时组）、6小时控制性机械通气组（CMV 6小时组）和12小时控制性机械通气组（CMV 12小时组），每组3只大鼠。模型建立后，采集膈肌组织进行苏木精-伊红染色、免疫组化染色以及RNA提取。苏木精-伊红染色用于评估病理变化并测定肌纤维横截面积；免疫组化用于检测慢速（MHCslow）和快速（MHCfast）肌球蛋白重链亚型的表达情况，并计算每个视野内的阳性区域比例；转录组测序（RNA-Seq）则用于分析各组间的mRNA表达差异。通过基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析，确定显著差异表达基因所关联的生物学功能及信号通路。

结果

苏木精-伊红染色显示，CMV 6小时组和12小时组的膈肌肌纤维均出现萎缩，同时伴有不同程度的炎性细胞浸润。定量分析表明，与对照组相比，CMV 6小时组的肌纤维横截面积显著降低（P＜0.05），而CMV 12小时组的这一数值进一步下降（P＜0.01）。免疫组化分析显示，CMV 6小时组中MHCslow和MHCfast的表达与对照组相比无显著差异（P＞0.05），但CMV 12小时组中这两种蛋白的阳性区域比例均显著降低（P＜0.05）。RNA-Seq分析显示，CMV 6小时组有2,048个差异表达基因（其中321个上调，1,727个下调）（P＜0.05），CMV 12小时组有1,495个差异表达基因（其中534个上调，961个下调）（P＜0.05）。GO分析显示，CMV 6小时组中有1,310个差异表达基因与分子功能（n=262）、细胞组分（n=179）和生物过程（n=869）相关（P＜0.05）；CMV 12小时组则有1,017个差异表达基因分别与上述三类相关（P＜0.05）。KEGG通路分析表明，CMV 6小时组和12小时组中显著性富集的前20条通路包括炎症反应、醛固酮合成与分泌、催产素信号通路、细胞外基质-受体相互作用以及胰岛素信号通路（P＜0.05）。在炎症反应中起重要作用的显著性富集通路主要为MAPK、PI3K-Akt和钙信号通路，这些通路中的关键基因已通过RT-qPCR技术进行了筛选和验证。

结论

MAPK、PI3K-Akt和钙信号通路及其相关基因与大鼠VIDD中的膈肌结构损伤和炎症反应密切相关，因此有必要进一步研究它们在膈肌功能障碍中的作用。