《npj Dementia》：Gut-bacterial amyloids can prime microglia against endogenous Amyloid-β and mediate neuroinflammation in Alzheimer’s disease
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摘要：肠道微生态日益被视为衰老及阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）的潜在驱动因素。AD的特征是神经元外间隙中β-淀粉样蛋白（Amyloid-β，Aβ）聚集形成斑块。肠道致病菌亦可产生类似的淀粉样蛋白以支持其生物膜形成，此类微生物淀粉样
摘要：肠道微生态日益被视为衰老及阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）的潜在驱动因素。AD的特征是神经元外间隙中β-淀粉样蛋白（Amyloid-β，Aβ）聚集形成斑块。肠道致病菌亦可产生类似的淀粉样蛋白以支持其生物膜形成，此类微生物淀粉样蛋白在AD及帕金森病（Parkinson's disease，PD）患者肠道中丰度较高，可通过肠-脑轴进入大脑并加剧神经退行病理。然而，在肠-脑轴背景下，微生物淀粉样蛋白与免疫细胞的交互作用及其如何塑造炎症反应尚不清楚。研究人员发现，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和大肠埃希菌（Escherichia coli）混合菌种淀粉样蛋白——菌毛蛋白FapC及Curli纤维蛋白CsgA（合称细菌淀粉样蛋白种子 bacterial amyloid seeds，BAS）——可致敏小胶质细胞，增强其对Aβ斑块的炎性反应。暴露于BAS的小胶质细胞吞噬Aβ原纤维并将其与BAS共同聚集成簇于吞噬体内；这促使小胶质细胞向促炎表型转化，形成ASC斑点（ASC specks）并呈现与神经炎症相关的蛋白质组学特征。不可被消化的聚集体形成具促炎互作组的复合物并被分泌至胞外，诱导旁观神经元进行性退变及认知功能下降，上述现象经人原代小胶质细胞、干细胞来源脑类器官及斑马鱼AD模型验证。结果表明，源自肠道致病菌的细菌淀粉样蛋白可通过肠-免疫-脑轴参与进行性神经退行病变的病理过程。
论文解读——《Gut-bacterial amyloids can prime microglia against endogenous Amyloid-β and mediate neuroinflammation in Alzheimer's disease》
一、研究背景与立项依据
阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是以细胞外β-淀粉样蛋白（Amyloid-β，Aβ）斑块沉积、tau蛋白神经纤维缠结及小胶质细胞（microglia）介导的神经炎症为核心特征的进行性神经退行性疾病。近年研究表明，肠道微生态失调（gut dysbiosis）及肠-脑轴（gut-brain axis）参与AD发生发展，AD及帕金森病（Parkinson's disease，PD）患者肠道中源自机会致病菌的功能性细菌淀粉样蛋白（microbial/bacterial amyloids）——如铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）FapC菌毛淀粉样蛋白及大肠埃希菌（Escherichia coli）CsgA Curli淀粉样蛋白——丰度显著升高，且可在体外交叉播种（cross-seed）加速Aβ与α-突触核蛋白（α-Synuclein，αS）聚集。然而，微生物淀粉样蛋白如何通过肠-脑轴影响脑内免疫细胞（尤指小胶质细胞）功能并调控神经炎症，仍是该领域缺失的关键环节。本研究旨在阐明混合菌种淀粉样蛋白种子（bacterial amyloid seeds，BAS；FapC+CsgA 1:1混合物）对小胶质细胞响应Aβ的调控机制及体内外病理效应。
二、主要关键技术方法概述
研究人员采用超声剪切法制备FapC与CsgA混合淀粉样蛋白种子（BAS），并与体外组装的Aβ1-42原纤维联用。细胞实验使用人小胶质细胞系HMC3、THP-1分化巨噬细胞（含稳定表达ASC-GFP的THP1-ASC-GFP报告细胞）及健康供外周血单核细胞诱导的人原代类小胶质细胞（monocyte-derived microglia-like cells，MDMi）。通过荧光共定位、酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）检测NLRP3、溶酶体相关膜蛋白1（Lysosomal-Associated Membrane Protein 1，LAMP1）、白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）及IL-1β，活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）检测，脂质红O染色排除脂滴干扰，透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy，TEM）、硫磺素T（Thioflavin T，ThT）荧光及偏振光显微镜鉴定交联β-片层结构，共培养体系追踪BAS+Aβ聚集体胞吐及神经元毒性。蛋白质组学采用数据非依赖采集（Sequential Window Acquisition of all Theoretical Mass Spectra，SWATH-MS/DIA-NN）分析细胞及聚集体表面互作组。人诱导多能干细胞（induced Pluripotent Stem Cells，iPSCs）来源含内源性小胶质细胞的脑类器官进行微注射及免疫荧光分析。体内实验采用成年斑马鱼（Danio rerio）经口灌胃BAS联合脑室微注射Aβ，评估脑内Aβ沉积、小胶质细胞活化（离子钙结合适配器分子1 Iba1、CD68）、突触素（synaptophysin）丢失、TUNEL阳性细胞、运动及记忆行为学。统计采用单因素方差分析（One-way ANOVA）与学生t检验。
三、研究结果
Fragmented seeds (BAS) of microbial amyloids FapC and CsgA in combination with Amyloid-β (Aβ) fibrils hyperactivate microglia towards a pro-inflammatory phenotype
研究人员发现HMC3小胶质细胞可特异性吞噬BAS并在胞内形成不规则聚集体，而同等浓度完整FapC、CsgA、Aβ原纤维及脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）对照无此现象且BAS无细胞毒性。经BAS预孵育再给予Aβ原纤维（BAS+Aβ组）显著上调NLRP3与LAMP1表达、IL-6分泌及ROS水平，并诱导Aβ被吞噬、压缩为较小胞内聚集体，此效应强于BAS单独、Aβ单独、BAS+BAS或Aβ+Aβ对照组，证实BAS致敏（prime）小胶质细胞使其对Aβ呈现超活化促炎响应。
BAS cluster with Aβ inside microglia and released to cause toxicity on bystander neuronal cells in vitro
共聚焦显微镜显示BAS与Aβ在HMC3吞噬体内共定位（Pearson相关系数≈0.8）。共培养实验中，BAS+Aβ聚集体被小胶质细胞胞吐并转移至SH-SY5Y神经元，导致神经元死亡及ROS升高；细胞裂解液（含聚集体）具神经毒性而条件培养基无毒，证实毒性源于胞吐的BAS+Aβ共聚集体。ThT荧光、偏振光双折射及TEM证实分泌聚集体保留交联β-片层结构，呈短而紧密棘状原纤维形态。
Proteomics signature of microglia with BAS and Aβ exposure are associated with neurodegeneration and a hyper-active phenotype
BAS+Aβ处理组小胶质细胞差异表达蛋白显著富集于AD相关及高活化表型，包括Rab-1A（自噬调节）、网格蛋白轻链A（Clathrin light chain A）、胞质肌动蛋白F-actin（吞噬相关）、载脂蛋白E（Apolipoprotein E，ApoE；BAS及BAS+Aβ组上调＞5倍Log2FC）、肌浆/内质网Ca2+-ATP酶2（Sarco/Endoplasmic Reticulum Calcium ATPase 2，SERCA2）、NEDD8、Stathmin-2、TDP-43、热休克蛋白70-1（Heat Shock Protein 70-1，HSP70-1，损伤相关分子模式 Damage-Associated Molecular Pattern，DAMP）、组蛋白变体H2A.Z及"don't eat me"信号分子CD47；神经元生长相关成纤维细胞生长因子-1（Fibroblast Growth Factor-1，FGF-1）与微管蛋白α-4b（Tubulin Alpha 4b，TUBA4B）在BAS+Aβ组下调最显著。
Protein interactome of BAS + Aβ clusters expelled by microglia indicate a hyper-active phenotype linked to AD pathology
超速离心纯化BAS+Aβ共聚集体表面吸附蛋白鉴定出微管蛋白α-1B（Tubulin alpha-1B，TUBA1B）、血红蛋白α亚基（Haemoglobin subunit alpha，HBA1）、波形蛋白（Vimentin）、膜联蛋白A5（Annexin A5）、神经元特异性烯醇化酶（Gamma-enolase）等与AD病理相关联的互作组蛋白。
Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD (ASC) speck formation increases following exposure to BAS + Aβ and exacerbates Aβ plaque formation in human monocyte-derived microglia-like cells (MDMi)
BAS+Aβ处理较各对照组显著促进THP1-ASC-GFP细胞及人原代MDMi中ASC斑点形成，并上调培养上清IL-1β与IL-6；NLRP3抑制剂MCC950可阻断IL-1β释放但仅部分抑制IL-6，提示BAS发挥致敏（priming）作用、Aβ发挥触发（triggering）作用激活NLRP3炎症小体（inflammasome）。
Human brain organoids injected with BAS + Aβ show colocalization of the clusters with microglia, promoting microglial activation and neurodegeneration
含内源性小胶质细胞的人脑类器官微注射BAS+Aβ后，BAS与Aβ共定位并被小胶质细胞（Iba1+）摄取，CD68+活化小胶质细胞比例显著高于Aβ或BAS单独组；β3微管蛋白（β3 tubulin）阳性神经元平均长度由PBS组52.32 μm降至25.16 μm，类器官培养上清IL-6升高六倍以上，证实BAS+Aβ聚集体在三维脑组织中引发小胶质细胞活化及神经元退变。
Zebrafish orally fed with BAS and cerebrally microinjected with Aβ exhibited higher neurotoxicity, and a decline in locomotor activity and memory
经口灌胃BAS联合脑内Aβ微注射斑马鱼较对照组出现更大Aβ斑块、CD68+小胶质细胞与Aβ共定位增强（Pearson≈0.781）、突触素表达下降及TUNEL+细胞增多；BAS+Aβ组游泳距离减少近4倍、探索区域缩小53%、记忆回避能力丧失（单菌淀粉样蛋白FapC或CsgA+Aβ效应介于PBS与BAS混合组之间），全脑匀浆IL-1β与IL-6升高，证实肠道来源细菌淀粉样蛋白通过系统/潜在肠-脑途径加剧Aβ神经病理及认知运动缺陷。
四、讨论与结论总结
讨论指出，本研究首次揭示肠道致病菌混合淀粉样蛋白种子（BAS＝FapC＋CsgA）可被小胶质细胞内吞并与Aβ共聚集形成不可降解促炎聚集体，致NLRP3炎症小体活化、ASC斑点形成及IL-1β/IL-6分泌，聚集体胞吐后转递邻近神经元引发退变；人原代小胶质细胞、iPSC脑类器官及斑马鱼模型一致证实BAS致敏小胶质细胞放大Aβ神经炎症并损害认知运动功能。单独BAS亦可轻度升高脑内炎性因子，提示除物理转运外，肠道局部炎症经迷走神经或循环细胞因子亦可影响脑内Aβ病理。研究承认尚未在人体证实微生物淀粉样蛋白经胃肠转运至脑，此为未来方向。
结论：铜绿假单胞菌FapC与大肠埃希菌CsgA细菌淀粉样蛋白（BAS）与Aβ原纤维协同激活小胶质细胞向促炎表型转化，二者在吞噬体内共聚集形成具促炎互作组的不可消化聚集体并被分泌，诱发旁观神经元退变及认知缺陷；经口给予微生物淀粉样蛋白联合脑内Aβ注射之斑马鱼呈现小胶质细胞过度活化、神经元死亡及运动记忆能力下降。该发现提示肠道病原菌来源细菌淀粉样蛋白可作为肠-免疫-脑轴分子触发器，通过致敏小胶质细胞重塑Aβ病理并介导AD进展。
