AFG3L2功能丧失导致发育性和癫痫性脑病

《CNS Neuroscience & Therapeutics》：Loss of Function of AFG3L2 Leading to Developmental and Epileptic Encephalopathy

　　

目的：描述AFG3L2相关发育性和癫痫性脑病（developmental and epileptic encephalopathy, DEE）的临床特征，并探索其致病机制。方法：对未确诊的DEE患者进行全基因组测序和血液转录组测序。建立患者来源的皮肤成纤维细胞，用于分析RNA和蛋白表达以及线粒体功能实验，包括OPA1加工、线粒体DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）拷贝数、膜电位、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate, ATP）产生、线粒体形态分析和线粒体压力测试。此外，系统回顾了已发表的AFG3L2相关癫痫病例。结果：研究人员在来自两个无关家系的四名DEE患者中发现了四个新的AFG3L2变异，包括一个家系中的剪接位点/内含子变异和另一个家系中的外显子缺失/内含子变异，符合常染色体隐性遗传模式。在这些患者以及另外六名先前报道的DEE患者中，症状包括严重发育迟缓、难治性癫痫发作、小头畸形、全身性痉挛和进行性脑萎缩。转录组和成纤维细胞功能分析揭示了异常剪接、AFG3L2表达降低、OPA1加工缺陷、mtDNA含量下降、膜电位和ATP产生受损、线粒体网络碎片化以及呼吸能力减弱，支持功能丧失机制。与痉挛性共济失调5型（通常涉及无效-错义或错义-错义基因型）相比，DEE主要呈现无效-无效组合。意义：研究人员提出AFG3L2是DEE的新致病基因，可能通过线粒体蛋白质稳态失败和生物能量损害发挥作用，扩展了AFG3L2相关疾病的表型和基因型谱。

**论文解读文章**

**研究背景与目的**
AFG3L2基因编码AFG3样蛋白2（AFG3-like protein 2），是线粒体基质ATP酶（matrix ATPases associated with diverse cellular activities, m-AAA）蛋白酶复合体的核心亚基，该复合体对维持线粒体稳态至关重要。此前，AFG3L2致病变异与视神经萎缩12型（optic atrophy 12, OPA12）、脊髓小脑性共济失调28型（spinocerebellar ataxia type 28, SCA28）和痉挛性共济失调5型（spastic ataxia 5, SPAX5）相关。近年少数研究报道双等位基因致病变异可导致肌阵挛癫痫或婴儿痉挛，但AFG3L2与癫痫的关系尚未明确。目前存在的问题是：AFG3L2双等位基因变异是否可作为发育性和癫痫性脑病（developmental and epileptic encephalopathy, DEE）的独立病因？其致病机制是什么？为此，研究人员对两个无关家系中四名DEE患者开展全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）和功能研究，以明确其遗传基础与潜在机制。

**研究内容与结论**
研究人员通过WGS和血液转录组测序（RNA sequencing, RNA-seq）鉴定四个新的复合杂合AFG3L2变异，并在患者皮肤成纤维细胞中验证其功能丧失效应。结论：AFG3L2功能丧失导致线粒体蛋白质稳态失衡和生物能量障碍，是DEE的核心致病机制，扩展了AFG3L2相关疾病的表型谱和基因型谱。该论文发表在《CNS Neuroscience》。

**关键技术与方法**
主要技术方法包括：全基因组测序（WGS）、血液转录组测序（RNA-seq）；患者来源皮肤成纤维细胞的分离与培养；定量实时聚合酶链反应（quantitative real-time PCR）和蛋白质印迹法（Western blotting）检测AFG3L2 mRNA和蛋白水平；线粒体功能实验：OPA1蛋白加工分析、线粒体DNA（mtDNA）拷贝数定量、线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential, MMP）检测、ATP产生测定、MitoTracker染色结合荧光显微镜线粒体形态分析，以及Seahorse细胞外流量分析仪进行线粒体压力测试（oxygen consumption rate, OCR）。样本队列来源：两个无关中国汉族家系（4例患者）及6例既往报道的DEE患者。

**研究结果**
**3.1 临床信息**
通过临床资料收集和脑磁共振成像（magnetic resonance imaging, MRI）分析，四例患者均表现为严重发育迟缓（6个月左右起病）、婴儿期难治性癫痫（主要为癫痫性痉挛）、小头畸形、全身性痉挛，伴或不伴基底节异常；脑MRI显示进行性全脑萎缩。血清乳酸轻度升高。抗癫痫药物反应差，预后不良（1例死亡）。

**3.2 通过全基因组测序鉴定AFG3L2双等位基因变异**
对家系1的病例1和病例2进行WGS，检出复合杂合变异：父源剪接供体位点变异（c.114+2T>C）和母源内含子变异（c.1426+19G>C）；家系2的病例3和病例4检出父源外显子7缺失（1632bp）和母源内含子变异（c.2176-6T>A）。所有变异符合常染色体隐性遗传模式，使用Combined Annotation Dependent Depletion（CADD）、SpliceAI和Pangolin等计算工具预测具有致病性。

**3.3 通过RNA测序鉴定AFG3L2异常表达和剪接事件**
对家系2病例3进行血液RNA-seq，FRASER分析发现与c.2176-6T>A相关的异常5'剪接位点（外显子17缩短19bp），及与外显子缺失相关的跳读外显子事件；OUTRIDER分析显示AFG3L2表达显著降低。家系1病例1和病例2中虽未检出典型异常剪接，但OUTRIDER分析亦显示AFG3L2表达显著降低，IGV可视化发现剪接连接数目减少，提示异常转录本可能被无义介导的mRNA降解（nonsense-mediated mRNA decay, NMD）所降解。

**3.4 皮肤成纤维细胞中AFG3L2 mRNA和蛋白表达降低**
从病例2及其母亲皮肤成纤维细胞中提取RNA和蛋白，定量实时PCR和Western blotting结果显示病例2的mRNA（相对表达0.127）和蛋白水平（相对表达0.2658）显著降低；母亲亦显示中度降低（mRNA 0.413，蛋白0.6849），证实变异导致AFG3L2表达下降。

**3.5 AFG3L2变异皮肤成纤维细胞中线粒体功能改变**
通过Western blotting分析OPA1加工，病例2成纤维细胞中长型OPA1与短型OPA1比值（L-OPA1/S-OPA1）显著降低，总OPA1表达轻度减少，表明OPA1加工缺陷。定量PCR显示病例2和母亲mtDNA拷贝数减少。使用TMRE荧光探针检测膜电位，病例2细胞MMP显著下降；ATP生物发光法显示ATP产生减少。MitoTracker染色和定量形态学分析显示，病例2线粒体平均面积、周长、长宽比和形态因子均降低，分支数、分支连接点、分支端点和平均分支长度减少，呈现显著网络碎片化。Seahorse分析显示，病例2的基线呼吸、最大呼吸、ATP产生和备用呼吸能力均显著低于对照，母亲细胞亦呈现轻度降低。以上结果支持AFG3L2功能丧失导致线粒体功能障碍。

**3.6 变异重分类**
根据RNA-seq和成纤维细胞功能证据，将c.1426+19G>C变异从意义未明变异（variant of uncertain significance, VUS）重分类为可能致病（标准：PS3+PM2_Supporting+PM3+PP4）。

**3.7 AFG3L2相关发育性和癫痫性脑病的表型和基因型**
综合10例患者（包括本研究的4例和既往6例），所有患者均表现为严重发育迟缓、难治性癫痫（以婴儿痉挛为主）、小头畸形、全身痉挛和进行性脑萎缩；脑电图常见高峰节律紊乱；均携带双等位AFG3L2功能丧失变异（6种不同变异）。

**3.8 AFG3L2相关神经系统疾病的基因型-表型关联**
与OPA12（主要位于AAA结构域的显性错义变异）、SCA28（主要位于蛋白水解结构域的显性错义或缺失变异）和SPAX5（以错义-无效或错义-错义复合杂合为主）相比，DEE以双等位无效-无效变异为特征，提示更完全的功能丧失导致更严重的表型。

**讨论与结论**
讨论部分指出：AFG3L2功能丧失导致m-AAA蛋白酶活性下降，破坏线粒体蛋白质稳态，引起OPA1过度裂解、线粒体碎片化、呼吸链受损、ATP产生减少和活性氧升高，最终可能导致神经元凋亡或坏死。钙缓冲失调可能促进神经元异常兴奋性。本研究通过WGS鉴定了非编码区和基因内缺失变异，强调WGS在传统外显子组测序阴性病例中的诊断优势。局限性包括：仅评估OPA1一种底物、缺乏神经元模型、队列较小。

结论翻译：本研究中，研究人员鉴定了一种与OMIM数据库中现有描述不同的常染色体隐性遗传AFG3L2相关表型。受影响个体表现出发育性和癫痫性脑病（DEE），特别是婴儿期癫痫性痉挛综合征，包括严重发育迟缓、小头畸形、婴儿期发作的难治性癫痫、发育倒退和进行性脑萎缩，伴或不伴MRI上基底节受累。结合转录组学和功能分析表明，AFG3L2功能的完全丧失是该疾病的核心致病机制。这些发现拓宽了AFG3L2相关疾病的临床和遗传谱，并强调了整合基因组和转录组测序在诊断不明原因DEE中的实用性。