通过工程化AAV载体和类淋巴系统递送实现体内人胶质祖细胞的高效靶向

《Nature Biotechnology》：Efficient targeting of human glial progenitor cells in vivo with engineered AAV vectors and glymphatic delivery

　　

治疗涉及少突胶质细胞或星形胶质细胞的神经系统疾病，将受益于病毒载体对其共同前体——胶质祖细胞（GPCs）的选择性递送。在此，研究人员选择具有人GPCs趋向性的腺相关病毒（AAV）衣壳，并证明通过类淋巴系统，将所得AAV高效且广泛地递送至小鼠全脑。在嵌合小鼠中，对衣壳修饰、重组报道的AAV文库进行体内筛选，这些小鼠移植了表达PDGFRA驱动的Cre重组酶的人GPCs，从而鉴定出一组基于AAV5的载体，这些载体在体内优先感染人GPCs和/或其星形胶质细胞和少突胶质细胞子代，且系统性感染极低。为了最大化这些载体的脑内分布，同时最小化其剂量和脑外扩散，研究人员将小脑延髓池递送与全身高渗状态相结合，以增加类淋巴系统流入。该方法绕过血脑屏障，将AAV直接递送至脑实质。对衣壳修饰的AAV5进行类淋巴系统递送，能够实现高效转基因递送至整个成年小鼠脑内的人胶质细胞，且脱靶转导极少。

**论文解读：工程化AAV载体与类淋巴系统递送实现体内人胶质祖细胞高效靶向**

**研究背景**
多种神经系统疾病，如进行性多发性硬化（PMS）、亨廷顿病（HD）、青少年发病精神分裂症和脑室周围白质软化症，均以脑白质萎缩、少突胶质细胞丢失和脱髓鞘为特征，且缺乏适应性再髓鞘化。尽管这些疾病中脑实质胶质祖细胞（GPCs）池仍然存在，但GPCs似乎丧失了有丝分裂和分化能力。为靶向这些细胞进行治疗干预，需要能够将遗传载荷递送至GPCs（特异性或同时递送至神经元）并仅靶向中枢神经系统（CNS）且系统性转导极少的载体。然而，现有AAV载体多偏向神经元，缺乏高效靶向人GPCs的体内筛选体系，且血脑屏障（BBB）阻碍了系统性给药后的脑内分布。因此，研究人员旨在开发一种结合体内衣壳进化与类淋巴系统递送的策略，以实现对GPCs及其子代（星形胶质细胞和少突胶质细胞）的高效、选择性基因递送。该研究发表在《Nature Biotechnology》。

**关键技术方法**
研究人员主要采用以下方法：1）构建PDGFRA-Cre人胚胎干细胞系（GENEA019），分化为人GPCs后移植至新生Rag1^-/-免疫缺陷小鼠脑内，建立人-鼠嵌合模型；2）在AAV5 VP1衣壳蛋白的唾液酸受体结合环（Q574-S575之间）插入随机21核苷酸（7肽）序列，构建含4×10⁵变异体的衣壳文库，并引入Lox66/Lox71侧翼的Cre依赖性重组报告序列；3）通过小脑延髓池注射结合全身高渗盐水（1M NaCl）和头低位Trendelenburg体位，增强类淋巴系统流入，实现AAV绕过BBB直接进入脑实质；4）提取感染后小鼠脑和肝的基因组DNA，通过PCR和二代测序识别Cre重组后的病毒序列，排除肝脏感染的变异体，筛选出高效感染人GPCs且系统性感染极低的衣壳变异体。

**研究结果**
**1. 表达Cre重组酶的人GPCs嵌合小鼠建立**
研究人员通过同源定向修复（HDR）将Cre基因敲入人胚胎干细胞（GENEA019）的PDGFRA位点，体外分化140-160天后，将人GPCs移植至新生Rag1^-/-小鼠前脑，6周后确认人供体细胞广泛定植，RNAScope证实PDGFRA-Cre mRNA表达。

**2. 高渗小脑延髓池递送实现AAV5广泛脑实质分布**
通过FITC-葡聚糖示踪验证，高渗小脑延髓池注射可诱导类淋巴系统流入，使AAV5和AAV5-retro（插入神经趋向性AAVrg衣壳序列）在脑内广泛分布，但未修饰的AAV5主要感染神经元，胶质细胞标记稀疏。

**3. AAV5衣壳进化可靶向体内人GPCs**
将衣壳文库（10μl, 1×10¹² vg/ml）注射至16周龄PDGFRA-Cre嵌合小鼠的小脑延髓池，1周后分析脑和肝。通过比较重组与非重组序列，排除肝脏靶向的变异体，从每只小鼠中选出5个最富集于人GPCs的衣壳，共20个变异体（CM1-CM20），其中CM1和CM6表现出高效感染人GPCs及不同的人与鼠感染偏好。

**4. 衣壳进化AAV5家族选择性感染GPCs和星形胶质细胞**
在12周龄非嵌合小鼠中，AAV-CM1优先感染Olig2标记的GPCs和少突胶质细胞系，AAV-CM6优先感染Sox9标记的星形胶质细胞。与未修饰AAV5相比，两者均显著增强胶质细胞趋向性，神经元感染率低于1%（P<0.0001）。

**5. 排除系统性感染的衣壳进化AAV**
通过PCR筛选，CM1和CM6在肝、脾、肾和背根神经节中几乎无感染。小脑延髓池注射后血浆病毒载量远低于静脉注射，且体外肝细胞感染实验显示AAV-CM1感染率显著低于AAV5。

**6. 衣壳进化AAV5在体内高效感染人胶质细胞**
在12月龄PDGFRA-Cre嵌合小鼠中，将AAV-CM1-Flex-EGFP与AAV5-Flex-dtTomato等量混合注射，3周后分析显示AAV-CM1感染的人GPCs比例显著高于AAV5（P<0.0001），证实其对人类胶质细胞的优越性。在16周龄人GPC嵌合小鼠中，AAV-CM1感染人Olig2+胶质细胞的比例为34.9%±5.7%，是AAV5的5.3倍；AAV-CM6感染人Sox9+星形胶质细胞的比例为22.2%±3.9%，是AAV5的3.8倍。

**7. CM1感染成熟少突胶质细胞及其祖细胞**
在16周龄人源化shiverer小鼠（MBP^shi/shi×Rag2^-/-）中，AAV-CM1高效感染胼胝体和皮质纹状体白质通路中CNPase和MBP标记的成熟有髓少突胶质细胞，以及星形胶质细胞和持续存在的GPCs。

**总结讨论与结论**
讨论部分指出，GPCs是基因治疗的重要靶点，但此前缺乏体内靶向人类细胞的AAV。本研究通过结合CREATE策略与人胶质细胞嵌合小鼠，在体内筛选出高效靶向人GPCs及其子代的AAV5衣壳变异体，并利用类淋巴系统递送绕过BBB，实现了低剂量、低系统性感染的广泛脑内分布。尽管CM1和CM6保留了部分神经元感染性，但胶质细胞趋向性显著增强，且可通过添加细胞类型特异性调控元件进一步优化。类淋巴系统递送结合全身高渗状态和体位调整，为临床基因治疗提供了安全有效的策略。
研究结论：越来越多的神经系统疾病被认识到具有胶质细胞病因或胶质病理，包括儿童酶/贮积症、成人髓鞘疾病（如PMS和年龄相关白质丢失）以及神经退行性疾病（如HD、精神分裂症、帕金森病和阿尔茨海默病）。本文描述的载体选择系统能够发现靶向体内人胶质细胞表型的AAV，同时推进了类淋巴系统递送途径（小脑延髓池注射联合全身高渗），这是一种微创方法，可最小化脑外病毒扩散并高效绕过BBB。该联合方法有望以临床安全有效的方式，将治疗性转基因高效、选择性地递送至目标脑细胞。