《Nature Genetics》：Identifying critical lysines in mammalian histone H3 with high-throughput CRISPR prime editing
编辑推荐：
摘要：组蛋白翻译后修饰（post?translational modifications, PTMs）是基因组调控的基础，但由于哺乳动物存在多个组蛋白基因拷贝，解析单个组蛋白标记的功能仍具挑战。研究人员开发了一个高通量成簇规律间隔短回文重复序列（cluster
摘要：组蛋白翻译后修饰（post?translational modifications, PTMs）是基因组调控的基础，但由于哺乳动物存在多个组蛋白基因拷贝，解析单个组蛋白标记的功能仍具挑战。研究人员开发了一个高通量成簇规律间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR）prime editing平台，可在天然基因组背景下对经典及非经典组蛋白H3基因进行精确、可逆且组合式的赖氨酸→精氨酸（lysine?to?arginine, K?to?R）点突变。研究人员以同义对照为基准，系统性地进行K?to?R取代，鉴定出包括H3K4、H3K9、H3K14、H3K18和H3K79在内的关键残基，其突变会损害小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells, ESCs）的适应性；进一步发现酵母和果蝇中与基因组稳定性相关的H3K56在哺乳动物细胞中也具有保守功能。通过对选定双突变体的分析，研究人员揭示了残基间的功能互作，如H3K27R＋H3K36R组合损害干细胞自我更新并改变转录。综上，本研究绘制了哺乳动物组蛋白H3赖氨酸的功能图谱，并为系统性解析染色质调控提供了广泛适用的平台。
研究背景与意义
在哺乳动物细胞中，组蛋白H3拥有多个基因拷贝（9个H3.1、3个H3.2编码复制依赖性经典组蛋白，2个H3f3a/b编码组成型H3.3变体），分散于不同染色体位点且无串联重复结构，传统基因敲除或酶水平干扰难以区分单个残基特异性功能。以往酵母和果蝇中的组蛋白系统性突变因模式生物局限性无法直接类推至哺乳动物。CRISPR碱基编辑虽可靶向组蛋白基因，但受编辑窗口窄、旁系突变及只能引入有限氨基酸替换的限制。为此，研究人员利用无需双链断裂和供体DNA的CRISPR prime editing（引导编辑），建立可同时靶向所有经典H3等位基因的高通量组蛋白点突变平台，在小鼠胚胎干细胞中原位系统鉴定各H3赖氨酸残基的功能并绘制功能图谱。该研究成果发表于《Nature Genetics》。
主要关键技术方法
研究人员构建可诱导表达PEmax-2A-MLH1dn（错配修复抑制因子 dominant-negative MLH1）-2A-BFP的TetO诱导系统（TPMB小鼠胚胎干细胞系，E14Tg2a来源），利用增强pegRNA（epegRNA）配合PE5b系统（含MLH1dn的prime editing系统 5b）对所有12个经典H3.1/H3.2基因同步引入精确K-to-R或同义K-to-K（lysine-to-lysine）突变；通过qPCR初筛单克隆、amplicon-based NGS（扩增子二代测序）确认编辑效率、Western blot及质谱验证组蛋白PTM丢失与突变组蛋白染色质整合；对H3.3变体单独设计epegRNA进行pan-H3全突变；采用CUT&Tag（Cleavage Under Targets & Tagmentation）和CUT&RUN（Cleavage Under Targets & Release Using Nuclease）进行组蛋白修饰和变体基因组占位分析；对双突变细胞进行RNA-seq并用DESeq2阶乘设计分析遗传互作；通过浅层全基因组测序评估大片段缺失等脱靶副产物；以同义K-to-K编辑为阴性对照区分生物学适合度效应与编辑偏差。
研究结果
Adapting prime editing for mammalian histone mutagenesis
研究人员针对H3K23设计epegRNA引入K23R及沉默PAM破坏突变，比较PE2、PE3b、PE4（含MLH1dn）和PE5b（PE4＋nicking sgRNA策略）系统，发现PE4/PE5b编辑效率最高且indel最低，选用可诱导PE5b的TPMB细胞系。单克隆筛选获得完全编辑全部18条H3.1等位基因的H3K23R克隆，Sanger测序、NGS及质谱证实全编辑，Western blot显示H3K23ac信号消失，证明prime editing可在天然背景下实现经典H3多位点完全K-to-R突变且H3K23对小鼠ESC自我更新非必需。
H3K14R and H3K18R mutations reduce cellular fitness
对H3K14和H3K18设计epegRNA进行K-to-R编辑，未获完全突变克隆且最大编辑效率低于H3K23（H3K14R＜67％，H3K18R＜50％），大量克隆仅发生PAM破坏而无K-to-R替换；部分编辑克隆碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, AP）集落形成能力下降，表明负选择。同条件K-to-K（沉默突变）对照可达70～100％编辑且无PAM-only富集，证实H3K14R和H3K18R引发适合度缺陷使高度编辑细胞被淘汰。
Prime editing enables reversible and combinatorial histone mutation
在完全H3K23R克隆中引入还原epegRNA将R23K复原，获得高效回复克隆且H3K23ac信号恢复，证明prime editing可实现组蛋白突变可逆。设计单epegRNA同时引入H3K14/K18/K23三重K-to-R或同义K-to-K突变，同义组合可高效安装而K-to-R组合效率低，与H3K14R/H3K18R适合度缺陷一致，说明平台支持组合编辑但受负选择限制。
Pan-H3 mutagenesis uncovers histone variant compensation
在已完全突变H3.1/H3.2K23R背景下再引入H3f3a/b K23R获pan-H3K23R克隆，H3K23ac完全消失。对H3K18R，先部分编辑H3.1/H3.2后叠加H3.3K18R可使H3K18ac进一步降低；CUT&Tag显示H3.1/H3.2K18R中H3K18ac重分布并与H3.3占位正相关，叠加H3.3K18R后重分布消失且全基因组H3K18ac轻度下降，质谱示H3.1/H3.2K18R中H3.3对H3.1/H3.2比值升高——表明H3.3变体可在特定位点补偿经典H3 K-to-R突变造成的PTM丢失。
Genomic by-products of histone mutagenesis by prime editing
浅层WGS发现个别克隆出现组蛋白簇1 Mb级拷贝丢失或kb级缺失，去除nicking RNA可降低部分位点的此类大片段缺失频率但不影响多数位点编辑效率；K-to-K与K-to-R克隆中大片段缺失频率无差异，说明属locus-dependent副产物，经筛选可获得无大片段扰动克隆。
Prime editing screen maps H3 lysine contributions to fitness
对全部13个经典H3赖氨酸逐一进行K-to-R与K-to-K编辑筛选。H3K4、H3K9、H3K14、H3K18、H3K79的K-to-R编辑效率显著低于对应K-to-K且有大量PAM-only富集（强负选择，无法获完全突变克隆）；H3K27R效率略降但无PAM-only富集（中度增殖缺陷）；H3K23R、H3K36R、H3K37R、H3K56R、H3K64R、H3K115R、H3K122R可获高/完全编辑克隆。H3K4因等位基因序列差异需5条epegRNA多重靶向，K-to-K本身效率低且K-to-R更差，印证强负选择。
Histone mutagenesis induces loss of PTMs and functional effects
Western blot证实H3K27R克隆丢失H3K27me2/me3，H3K36R丢失H3K36me2/me3，H3K37R丢失H3K37me1，部分H3K79R丢失H3K79me2/me3；CUT&Tag/CUT&RUN验证全基因组对应修饰丢失。H3K56R完全编辑克隆对依托泊苷（etoposide）DNA损伤剂敏感性显著增加，表明H3K56ac在哺乳动物细胞中介导基因组稳定性的功能保守。A485（CBP/p300抑制剂）处理降低H3K18ac并致细胞死亡，与H3K18R适合度缺陷呼应。
Combinatorial H3 lysine mutations reveal functional crosstalk
以高编辑单突为起点进行二次编辑获H3K23R+H3K27R、H3K36R+H3K27R、H3K27R+H3K37R、H3K23R+H3K37R双突变克隆。H3K27R+H3K36R和H3K27R+H3K37R双突变集落形成能力低于单突变；RNA-seq阶乘DESeq2分析示大多基因为上位性（epistatic）响应，部分基因为新生（emergent）响应——下调Klf4、Chd4、Sin3a，上调Fgfr2、Dkk，符合干细胞多能性基因下调与分化倾向，揭示H3K27me与H3K36me修饰间存在功能性染色质互作。
讨论部分总结（翻译浓缩研究结论）
本研究建立了基于prime editing的小鼠ESC组蛋白H3赖氨酸系统性诱变平台，可实现精确、多重、可逆及变体特异编辑。瞬时错配修复抑制（MLH1dn）显著提升编辑效率，nicking RNA在某些位点增加大片段缺失但非必需。H3K4、H3K9、H3K14、H3K18、H3K79的强适合度缺陷与果蝇表型平行；H3K18R在ESC中强负选择与果蝇存活差异可能反映物种或取代方式不同。部分编辑突变体可用于适合度关键残基功能解析——H3K18R中H3.3变体在特定H3K18ac标记位点补偿修饰丢失，说明组蛋白变体可介导上下文依赖的PTM补偿。可兼容增殖的K-to-R突变不等于功能冗余，其在发育、分化或胁迫下可能有表型。双突变（含H3K27R+H3K36R）在标准培养可增殖，转录互作多为上位性但也有缓冲和新现响应，支持H3K27me与H3K36me修饰拮抗及额外染色质互作层。K-to-R突变消除该位点所有PTM且折叠区突变可能影响核小体结构，需结合修饰酶扰动解读。该平台可拓展至其它组蛋白、致癌组蛋白（oncohistone）及重复元件功能解析。
