一种混合基因组和外显子组测序方法以无偏且经济高效的方式捕获遗传变异

《Nature Genetics》：A blended genome and exome sequencing method captures genetic variation in an unbiased and cost-effective manner

　　

这里研究人员开发并部署了混合基因组外显子组（BGE）方法，这是一种DNA文库方法，可在单次测序运行中生成低深度全基因组（平均深度1–4×）和深度全外显子组（平均深度30–40×）数据。BGE具有成本效益，可实现深度全基因组测序所能实现的大部分基因组发现，并捕获全球常见单核苷酸多态性（SNP）多样性。研究人员将BGE应用于PUMAS项目（精神疾病关联研究中代表性不足的人群）的超过53,000个样本，包括非洲人、非裔美国人和拉丁美洲人群。插补基因型与Illumina全球筛选阵列（GSA）的检测结果具有高度一致性（对于次要等位基因频率（MAF）≥1%，R²≥95%；对于MAF<1%，R²≥90%），且在混合队列中不同局部祖先背景下表现一致。对于蛋白质编码拷贝数变异（CNV），跨越至少三个外显子的缺失和重复相对于深度全基因组数据具有约90%的阳性预测值（PPV）。以深度全基因组测序成本的约28%，BGE提供了一个可扩展、可靠的平台，以扩大基因组发现并促进代表性不足人群公平获取测序。

论文解读：

**研究背景与问题**

全基因组关联研究（GWAS）在过去15年间呈指数级增长，已识别出数十万个遗传变异与人类性状之间的关联。然而，当前主要使用的基因分型技术——微阵列芯片，由于设计上的偏差，导致对遗传变异的偏倚检测，尤其在欧洲祖先人群中常见。低深度全基因组测序（low-pass WGS）虽可作为成本有效的替代方案，更准确地捕获等位基因频率谱中的变异，但其在检测罕见编码变异方面能力有限。深度全外显子组测序（deep WES）虽能捕获可解释的罕见编码变异，但成本较高，且通常需与GWAS阵列联合使用，导致流程复杂且样本间数据不一致。现有方法难以在成本、覆盖范围和变异检测全面性之间取得平衡，尤其是在基因组学研究中代表性不足的人群中。为此，研究人员开发了混合基因组外显子组（BGE）方法，旨在通过单一测序运行同时获得低深度全基因组和深度全外显子组数据，实现无偏、高质量且经济高效的遗传变异捕获。

**研究内容与结论**

研究人员在PUMAS项目（精神疾病关联研究中代表性不足的人群）中对超过53,000个样本应用BGE测序，包括非洲人、非裔美国人和拉丁美洲人群。通过迭代实验优化BGE协议，确定最佳混合比例（33%外显子组:67%基因组），实现每样本1–4×全基因组及30–40×外显子组覆盖。研究显示，插补基因型与Illumina全球筛选阵列（GSA）数据高度一致（MAF≥1%时R²≥95%），且在不同局部祖先背景下表现稳定。对于蛋白质编码拷贝数变异（CNV），跨越至少三个外显子的缺失和重复具有约90%的阳性预测值（PPV）。BGE成本仅为深度全基因组测序的约28%，同时捕获了94.4%的常见和94.7%的罕见编码变异（与30×WGS相比），远超GSA阵列（66.1%和27.6%）。该研究发表在《Nature Genetics》上，证明了BGE作为可扩展、可靠平台的优势，能够扩大基因组发现并促进代表性不足人群的公平测序访问。

**主要技术方法概括**

BGE方法的核心是将PCR-free全基因组文库与外显子捕获文库按33%外显子组:67%基因组比例混合，在NovaSeqS4上测序。样本队列来源包括PUMAS项目下的Genomic Psychiatry Cohort（GPC，主要来自美国非裔和拉丁裔人群）、NeuroGAP-Psychosis研究（来自埃塞俄比亚、肯尼亚、南非和乌干达）以及Paisa研究（来自哥伦比亚混血人群）。此外，使用Simons Simplex Collection（SSC）的400个家系样本进行CNV基准测试。主要数据分析方法包括：GATK-gCNV用于外显子CNV检测，GLIMPSE2用于低深度全基因组插补（参考面板为HGDP+1kGP），VISTA和INSurVeyor用于结构变异检测，RFMix2用于局部祖先推断。

**研究结果**

**The BGE protocol balances cost with genotype quality**：通过六轮迭代实验，研究人员确定33%外显子组与67%基因组混合、每通道64个样本的比例可提供每样本30–40×外显子覆盖和1–4×全基因组覆盖，实现与30×WGS常见变异（MAF>5%）的R²一致性>99%，且成本最低。

**BGE QC at scale on diverse participants**：对53,446个PUMAS样本进行质量控管，血液样本的覆盖略优于唾液样本，但所有队列中未达到外显子覆盖阈值的样本比例均低于1%。外显子部分平均检出率>0.99，平均读取深度>30，平均基因型质量>39，经祖先分层过滤后保留88%的样本。

**Accurate CNV and structural variant discovery**：在SSC的400个家系样本中，使用GATK-gCNV从BGE外显子数据检测CNV，与深度WGS的黄金标准相比，对跨越五个以上外显子的CNV召回率为87%，对三个以上外显子的PPV约为90%。所有11个经验证的de novo CNV均被BGE检测到，无假阳性。血液与唾液样本的CNV检出率无显著差异。对于结构变异，使用VISTA和INSurVeyor在SSC样本中检测，缺失的PPV平均为99.14%，但召回率平均为34.78%；插入的PPV平均为79.31%，召回率平均为23.04%。

**High concordance between imputed BGE and GWAS array data**：使用GLIMPSE2对BGE低深度全基因组数据进行插补，得到超过6700万个双等位基因SNP。与GSA阵列数据比较，所有队列在MAF≥0.005的区间内聚集R²均超过90%。外显子变异在低频时一致性高于非外显子区域，例如在MAF=0.01时，NeuroGAP-Psychosis队列的外显子一致性超过0.95。

**BGE imputation quality across ancestries**：在Paisa和GPC队列中，按局部祖先背景分层分析插补准确性。对于常见变异（MAF≥1%），不同祖先背景（非洲、欧洲、美洲混血）的R²和一致性均>90%。在低频变异中，美洲混血（AMR）祖先在Paisa队列中R²略低于欧洲和非洲祖先，但差异小于10%。

**BGE provides a cost-effective balance of variants**：在79个NeuroGAP-Psychosis样本中比较BGE、GSA阵列和30×WGS的变异捕获数量。BGE捕获了94.4%的常见编码变异和94.7%的罕见编码变异，而GSA仅捕获66.1%和27.6%。在非编码区域，BGE插补的常见变异（79.8%）和罕见变异（61.2%）比例也高于GSA（67.6%和24.5%）。

**总结讨论与结论**

讨论部分指出，BGE方法通过将文库制备按优化比例混合后测序，实现了成本降低（仅为WGS成本的28%），同时简化了流程，避免了WGS与WES数据之间的样本失败。BGE在低深度全基因组插补中表现出高准确性，但插补准确性受参考面板选择影响，例如AMR祖先的R²较低，原因是HGDP+1kGP参考面板中美洲原住民单倍型不足。BGE在外显子CNV检测中表现出高召回率和PPV，但受限于较低的外显子覆盖，对小于五个外显子的CNV召回率略低。结构变异检测方面，PPV高但召回率低，需进一步改进。BGE技术在常见变异插补中表现稳健，适用于未来多样本参考面板。研究结论部分翻译如下：研究人员在高度祖先多样化的队列中进行的评估确立了BGE测序作为一项弥合大规模基因组研究中成本、全面覆盖和数据质量之间差距的技术。其高质量的外显子数据、可靠的CNV检出以及跨多样人群的准确全基因组插补，使其成为推进基因组研究的有价值工具。通过支持更具包容性的研究，BGE技术有潜力增强研究人员对遗传变异及其对全球人类健康影响的理解。