单核RNA测序揭示斑马鱼发育中GnRH3神经元内的异质性

《Journal of Neuroendocrinology》：Single-nuclei RNA sequencing reveals heterogeneity within developing GnRH3 neurons in zebrafish

　　

促性腺激素释放激素（GnRH）是脊椎动物生殖的中枢调节因子，调控垂体促性腺激素。在斑马鱼中，GnRH3作为促垂体型同工型。其神经元通过从鼻基板迁移至下丘脑发育，沿迁移路径形成数个不同的亚群。然而，这种迁移的分子异质性仍未被完全理解。为描绘分子与空间异质性，研究人员对来自7 dpf Tg(gnrh3:EGFP)斑马鱼的、基于gnrh3启动子驱动的EGFP荧光富集的细胞核进行了单核RNA测序（snRNA-Seq）。随后进行GnRH3神经元聚类、差异表达基因鉴定、作为假设生成框架的轨迹推断以及功能分析。挑选标记基因，并通过在原位杂交（ISH）和免疫组织化学（IHC）中对幼虫和成年斑马鱼进行验证，以确定每个亚簇的分布。鉴定出三个以高表达标记基因为特征的亚群：Gnrh3^cyp1a、Gnrh3^nrg1和Gnrh3^npffl/prl2。Gnrh3^npffl/prl2进一步聚类为两个亚群，即Gnrh3^npffl/prl2和Gnrh3^npffl，它们定位于嗅球/终神经和端脑，而Gnrh3^cyp1a和Gnrh3^nrg1则检测于嗅上皮内的不同细胞中。轨迹推断和基因本体（GO）富集分析支持一个假定的从Gnrh3^cyp1a到Gnrh3^npffl/prl2状态的转录组连续性，后者缺乏典型的迁移基因特征。蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析揭示了差异表达基因之间的相互作用关系，一个与GnRH3相关的相互作用模块进一步支持了上述标记基因的选择。研究人员的实验结果支持至少存在三个具有不同转录组和特征的GnRH3亚群，为解析GnRH3在迁移和生殖中的多样功能提供了更广泛的基础。

**论文解读**

促性腺激素释放激素（GnRH）是脊椎动物生殖轴的上游调控因子，在斑马鱼中，GnRH3作为促垂体型同工型，其神经元在发育过程中从鼻基板迁移至下丘脑，形成沿迁移路径分布的多个亚群。然而，当前对于这种迁移过程中分子异质性的理解尚不完整，现有研究主要基于形态学或少数分子标记，缺乏全转录组层面的系统解析。此外，先天性低促性腺激素性性腺功能减退症（CHH）中已鉴定的分子仅能解释不足50%的病例，提示存在尚未揭示的迁移相关基因。为阐明GnRH3神经元在迁移过程中的分子和空间异质性，研究人员开展了本项研究。

研究人员利用来自7 dpf Tg(gnrh3:EGFP)斑马鱼（该品系由马里兰大学海洋与环境技术研究所（IMET）维护）的、基于gnrh3启动子驱动的EGFP荧光富集的细胞核，进行单核RNA测序（snRNA-Seq）和生物信息学分析，并通过原位杂交（ISH）和免疫组织化学（IHC）在幼虫和成年斑马鱼中验证标记基因的表达定位。研究结果支持存在至少三个转录组特征各异的GnRH3相关亚群/状态，论文发表于《Journal of Neuroendocrinology》。

主要关键技术方法包括：使用荧光激活细胞核分选（FACS）从7 dpf Tg(gnrh3:EGFP)斑马鱼幼虫全组织中分选EGFP阳性细胞核（样本来源：马里兰大学IMET的斑马鱼品系）；利用10× Genomics Chromium平台和Illumina NovaSeq 6000进行snRNA-Seq文库制备与测序；使用Seurat进行核聚类和差异表达基因（DEG）鉴定；采用Dynverse包进行轨迹推断（假设生成框架）；利用clusterProfiler进行基因本体（GO）富集分析；通过STRING数据库和Cytoscape构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络；使用杂交链式反应（HCR）RNA-FISH对幼虫进行整体原位杂交，对成年脑片进行HCR RNA-FISH和IHC检测标记基因共定位。

**研究结果**

**2.1 鉴定共表达gnrh3和标记基因的核亚簇**
对从7 dpf Tg(gnrh3:EGFP)幼虫中分选的4307个EGFP富集核进行snRNA-Seq和聚类分析，鉴定出17个簇，其中簇0和簇1的gnrh3和GFP表达显著高于其他簇。对具有可检测核gnrh3转录本的55个核进行二次聚类，获得三个亚簇（Gsubcluster0-2），分别有22、17和16个核。通过DEG分析筛选出代表性标记基因：Gsubcluster0高表达cyp1a和pvalb2等；Gsubcluster1高表达nrg1等；Gsubcluster2高表达npffl和prl2等。对22个与GnRH神经元功能相关基因的功能分类显示，这些基因在发育、迁移、分泌与功能、轴突导向与突触连接以及Kallmann综合征/CHH等类别中存在重叠分布。

**2.2 单核轨迹推断和功能分析揭示GnRH3亚群间假定转录组关系**
利用前90个DEG进行轨迹推断，将三个亚簇沿伪时间轴排列：Gsubcluster0富集于早期伪时间，Gsubcluster1处于中间，Gsubcluster2富集于晚期。GO富集分析显示：Gsubcluster0的DEG富集于核糖核蛋白复合物组装等生物学过程（BP）和核糖体亚基等细胞组分（CC）；Gsubcluster1的DEG富集于中间纤维（CC）和钙依赖性蛋白结合（分子功能，MF）；Gsubcluster2的DEG富集于神经元突起发育和细胞-细胞连接（BP）以及轴突（CC）。PPI网络分析显示，包含gnrh3在内的相互作用模块中，npffl和prl2直接与gnrh3相互作用，prl2还与cyp1a相互作用，支持了这些标记基因的选择。

**2.3 不同Gsubcluster选定标记的定位**
在7 dpf Tg(gnrh3:EGFP)幼虫中进行整体ISH和IHC：cyp1a与Gnrh3共定位于嗅基板（OP）/嗅上皮（OE）和嗅球（OB）；npffl和prl2共定位于OB和终神经（TN）；nrg1在幼虫GnRH3神经元中未被检测到。双ISH显示，cyp1a与prl2或npffl不共表达，且cyp1a表达水平在OB中较低并沿迁移路径逐渐下降。

**2.4 成年脑中npffl、prl2、cyp1a和nrg1在GnRH3神经元中的共表达**
在成年雌性斑马鱼脑片中：npffl mRNA在OB和端脑（TEL）的所有GnRH3神经元中表达，但不在视前区（POA）表达；prl2仅表达于OB中较大的GnRH3神经元，TEL和POA的GnRH3神经元不表达prl2，此外在视前核后部（PPp）发现一群新的非GnRH3的prl2表达群体。在成年雄性斑马鱼中，cyp1a mRNA定位于OE的嗅叶（OL）的GnRH3神经元，雌性中则定位于OE的中央核心（CC）区域；NRG1仅在与雄性OE-OL的GnRH3神经元共定位，雌性中未检测到。GFP荧光强度在OB/OE区域的GnRH3神经元中存在差异，表达cyp1a的神经元GFP强度高于表达nrg1的神经元。

**讨论与结论**

讨论部分指出，snRNA-Seq鉴定出的三个亚群（Gnrh3^cyp1a、Gnrh3^nrg1、Gnrh3^npffl/prl2）呈现不同的空间分布和转录组特征。轨迹推断和GO分析支持从OE相关状态（Gnrh3^cyp1a）到OB/TN相关状态（Gnrh3^npffl/prl2）的假定转录组连续性，但需纵向验证来确定是否为依次的发育转换。此外，ndffl和prl2与gnrh3的直接相互作用、cyp1a在OE中可能参与环境毒素代谢和生殖调控、nrg1在神经发育和突触可塑性中的作用，以及OE中GnRH3神经元（可能为隐窝感觉神经元）调控性信息感知等功能，均提示这些亚群具有不同的生理角色。研究还观察到OE中性别二态性（雄性有nrg1阳性、雌性无）和GFP强度异质性，暗示不同GnRH3神经元亚群可能对应不同的发育或迁移程序。最后，snRNA-Seq的低核gnrh3转录本检测率受生物学稀有性、核内转录本低丰度及技术限制的影响，但通过保守的gnrh3表达锚点进行亚群探索仍具合理性。

**研究结论**：本项研究支持斑马鱼中至少存在三个分子特征不同的GnRH3相关亚群/状态，具有不同的转录组特征。单核轨迹推断和GO富集分析提示了这些状态之间的假定关系，并突出了候选的迁移或发育相关程序。此外，研究结果揭示了亚簇内的表达变异性，暗示GnRH3神经元存在时间或状态依赖的异质性。对鉴定出的标记基因进行后续遗传和生化操作，有望为理解GnRH神经元在个体发生过程中的迁移内在机制提供有价值的见解。