缺氧通过恢复蛋白质稳态缺陷挽救复合体I相关疾病

《Nature Metabolism》：Hypoxia rescues complex 1-associated disease caused by proteostatic defects

　　

摘要：线粒体蛋白质稳态受损是多种疾病的基础，然而有效的治疗方法仍然有限。本研究表明，HTRA2（一种线粒体膜间隙蛋白酶）的缺陷可以通过缺氧疗法得到挽救。利用一个表现出严重神经退行性变和早期死亡的Htra2突变小鼠模型，研究人员发现持续缺氧可挽救纹状体退行性变并延长寿命。在机制上，研究人员证明HTRA2与解聚酶CLPB（钾转运缺陷抑制因子3，Skd3）形成一个功能性复合物。任一蛋白的功能丧失都会驱动电子传递链复合体I（C1）中面向膜间隙亚基的聚集，导致继发性C1功能障碍。这些变化损害组织耗氧，并可能引起病理性组织高氧，而缺氧可纠正这一状态。综上所述，这些发现定义了一条将膜间隙质量控制与C1功能联系起来的蛋白质稳态通路，并扩展了缺氧疗法在继发性C1疾病中的应用潜力。

**论文解读：缺氧疗法通过恢复线粒体蛋白质稳态挽救复合体I相关疾病**

**研究背景与问题提出**

线粒体电子传递链（ETC）消耗超过90%的细胞氧气以驱动有氧ATP生成并防止组织中有毒氧的积累。氧气作为底物和毒素的双重角色要求氧气输送与线粒体消耗之间的紧密协调。在五个ETC复合体中，复合体I（C1）是最大且最复杂的，由超过40个亚基组成，分为NADH氧化（N-模块）、醌结合（Q-模块）和质子泵送（P-模块）功能模块。C1功能缺陷与多种疾病相关，从罕见的先天性错误（如Leigh综合征，由C1亚基或组装因子突变引起）到更常见的神经退行性疾病（如帕金森病）。此前研究发现，缺氧是治疗线粒体疾病的强大策略，在由Ndufs4缺失引起的Leigh综合征小鼠模型中，暴露于11%氧气可延长生存期并逆转神经退行性变，这种效应并非通过经典的低氧诱导因子（HIF）信号介导，而是反映了缺氧通过纠正病理性氧积累实现正常化。然而，这些发现主要局限于体外细胞培养，尚不清楚缺氧在体内不同疾病背景下是否具有相似疗效，以及其挽救机制是否在不同遗传性疾病的病灶中共享。理解这些缺氧反应性疾病的共同病理生理特征将有助于阐明哪些疾病可能从缺氧治疗中获益及其原因。本研究选择疾病基因HTRA2作为模型，探讨上述关键问题。

**研究内容与主要结论**

研究团队发现，HTRA2缺陷通过破坏线粒体膜间隙（IMS）蛋白质稳态导致C1亚基聚集、C1不稳定和功能障碍，进而引起组织高氧和下游毒性，而吸入性缺氧可通过恢复氧气稳态有效挽救这一病理过程。具体而言，在Htra2突变小鼠模型中，连续缺氧暴露将中位生存期延长近三倍，并显著改善运动功能，同时挽救纹状体炎症。机制上，HTRA2与IMS解聚酶CLPB形成功能性复合物，协同维持IMS蛋白质稳态：CLPB促进聚集物再溶解，HTRA2促进其降解。任一蛋白的缺失均导致C1中面向IMS的亚基（如NDUFA13）聚集，引发C1组装受损和继发性功能丧失，降低线粒体耗氧，造成局部组织高氧。缺氧通过降低周围氧浓度纠正高氧状态，恢复ISC蛋白稳定性和HIF靶基因表达。此外，研究还发现CLPB缺陷同样导致C1不稳定，且CLPB和HAX1也属于缺氧可挽救的基因，提示缺氧疗法可能适用于更多由线粒体蛋白质稳态缺陷引起的疾病。该研究发表在《Nature Metabolism》。

**主要技术方法**

研究中使用的主要关键技术方法包括：1）CRISPR全基因组筛选（在K562细胞系中进行，鉴定缺氧可挽救的基因）；2）Htra2突变小鼠模型（mnd2突变，C57BL/6J背景）的体内缺氧暴露实验；3）定量蛋白质组学（TMT标记和DIA-PASEF模式，分析K562细胞、HEK293T细胞及小鼠纹状体组织）；4）RNA测序（小鼠纹状体，QuantSeq 3′ mRNA-Seq文库）；5）蓝-native PAGE（BN-PAGE）和C1活性测定（Seahorse呼吸仪）；6）免疫共沉淀（IP）和质谱分析（HEK293T细胞，内源性条件）；7）沉降实验（分离可溶与聚集组分）；8）体外重组蛋白解聚/降解实验（荧光素酶和NDUFA13聚集物）；9）免疫荧光染色（Iba1和Gfap标记神经炎症）；10）冷冻电镜断层扫描（cryo-ET）分析线粒体嵴形态。样本队列来源：K562细胞（ATCC）、HEK293T细胞（UCSF细胞与基因组工程核心）、小鼠（Jackson Laboratory，C57BL/6J背景）。

**研究结果**

**缺氧在体外和体内挽救HTRA2缺陷**：通过全基因组CRISPR筛选，研究人员发现HTRA2敲除（KO）细胞在常氧下存在显著的适应性缺陷，而缺氧可挽救该缺陷。在Htra2突变小鼠（mnd2突变）中，从出生后第11天开始暴露于11%氧气，中位生存期延长近三倍，且雄性雌性均有效。缺氧还轻度恢复了体重，显著改善了倒挂网格和旋转杆测试中的运动功能。脑组织免疫荧光显示，缺氧可挽救纹状体炎症（Iba1和Gfap染色阳性区域减少），但丘脑炎症未获挽救，表明存在区域特异性脆弱性和挽救差异。

**HTRA2缺陷导致体外和体内C1不稳定**：蛋白质组学分析显示，HTRA2 KO细胞中C1亚基（尤其是N-模块）丰度显著降低，缺氧可部分恢复其水平。BN-PAGE和C1活性测定表明，HTRA2 KO细胞中C1组装和活性下降，但缺氧仅轻度增加组装的C1，未改善其酶活性，提示缺氧的主要机制并非恢复C1电子传递。在Htra2突变小鼠纹状体中，蛋白质组学也证实C1亚基下调，且缺氧可部分恢复。进一步分析发现，突变小鼠纹状体中含铁硫簇（ISC）蛋白丰度降低，HIF靶基因表达下调，提示存在组织高氧状态。缺氧后这些指标趋于正常化，支持缺氧通过纠正组织高氧和氧气毒性发挥挽救作用。

**HTRA2与线粒体IMS蛋白解聚酶CLPB功能相关**：通过依赖图谱（DepMap）共必需性分析，研究人员发现HTRA2与CLPB、HAX1等线粒体质量控制基因高度共必需。BioID邻近标记数据也显示CLPB和HAX1与HTRA2物理邻近。在Htra2突变小鼠纹状体线粒体中，ClpB和Hax1出现聚集，表明它们相互依赖以维持可溶性。这些结果表明HTRA2与CLPB在IMS蛋白质稳态中形成协同网络。

**CLPB与HTRA2竞争聚集底物，并同样维持C1稳定性**：免疫共沉淀验证了HTRA2与CLPB的物理相互作用。体外实验显示，CLPB可部分保护聚集的荧光素酶免受HTRA2降解（竞争性结合），而HTRA2以剂量依赖方式抑制CLPB介导的荧光素酶再激活（降解底物）。CLPB KO细胞的蛋白质组学同样显示C1亚基广泛缺失，与HTRA2 KO细胞表型相似。因此，HTRA2与CLPB协同处理IMS中聚集或错误折叠的底物，维持C1稳定性。

**HTRA2–CLPB蛋白质稳态控制NDUFA13可溶性和C1稳定性**：通过整合CLPB KO条件下聚集的蛋白与HTRA2 IP蛋白组学，研究人员鉴定出多个共同靶点，包括C1亚基NDUFA13、NDUFA8和NDUFB10以及线粒体蛋白输入亚基TIMM50。沉降实验证实，HTRA2和CLPB KO细胞中NDUFA13均发生聚集，且TIMM50也出现聚集。体外切割实验表明，纯化的HTRA2可识别并切割聚集的NDUFA13。因此，HTRA2和CLPB通过直接作用于IMS-facing的C1亚基（如NDUFA13）维持其可溶性和组装能力，其缺失导致C1不稳定。此外，HTRA2和CLPB的缺失可能通过影响线粒体嵴结构（MICOS复合物相关）间接破坏C1，Htra2突变小鼠脑组织线粒体cryo-ET也观察到嵴形态异常。最后，CLPB和HAX1的KO细胞在CRISPR筛选中同样表现出缺氧挽救，提示缺氧疗法可扩展至其他线粒体蛋白质稳态疾病。

**讨论与结论**

研究人员此前证明缺氧可显著延长Ndufs4 KO小鼠（原发性C1疾病模型）的寿命并逆转神经缺陷。本研究发现线粒体蛋白质稳态的关键调节因子HTRA2和CLPB的缺失也属于缺氧可挽救的范畴，其共同机制是C1功能障碍导致耗氧下降和局部组织高氧，而缺氧通过降低环境氧张力逆转这一病理状态。然而，并非所有ETC功能障碍都对缺氧敏感；C1缺陷可通过无氧糖酵解和替代氧化还原通路部分补偿，而复合体II–IV的严重缺陷可能具有更广泛的代谢后果。缺氧疗法可能对C1功能障碍为核心、主要病理驱动因素为局部高氧的疾病最有效。线粒体蛋白质稳态缺陷在多种疾病中普遍存在，缺氧通过调节翻译速率、减少新生蛋白流入应激细胞器或改变线粒体蛋白输入动力学，可能全面缓解蛋白质稳态压力。此外，区域特异性表现（如纹状体病变可挽救，丘脑不可）提示未来需关注细胞类型和脑区差异。研究还揭示了HTRA2与CLPB在IMS中的协作关系：CLPB作为解聚酶，HTRA2作为蛋白酶，共同作用于IMS-facing的C1亚基（如NDUFA13），去除错误折叠分子以维持高效C1生物合成。HAX1也参与其中，为HTRA2的加工激活所必需。长期目标是转化这些发现为治疗策略，例如开发模拟缺氧效应的小分子HypoxyStat，其通过增加氧与血红蛋白结合亲和力，降低组织氧释放，已在Ndufs4 KO小鼠中显示体内疗效，未来将开发衍生物以更早干预线粒体蛋白质稳态疾病。

**研究结论翻译**：这些发现定义了一条将膜间隙蛋白质稳态与C1稳定性联系起来的共同疾病机制，并提供了一个框架，用于识别缺氧反应性线粒体疾病，从罕见代谢综合征到更常见的神经退行性和年龄相关疾病。