小鼠小胶质细胞TDP-43介导髓鞘精细化修剪并抑制Tyrobp隐蔽外显子（cryptic exon） inclusion

《Nature Neuroscience》：Microglial TDP-43 mediates myelin refinement and represses Tyrobp cryptic exon inclusion in mice

　　

摘要：TDP-43蛋白病（TDP-43 proteinopathy）是肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶痴呆（FTD）等神经退行性疾病的标志，其特征为TDP-43在神经元及胶质细胞中错位分布，然而TDP-43在小胶质细胞中的作用及其功能缺失（loss of function）的后果尚不清楚。研究人员结合磁共振成像（MRI）、共聚焦显微镜及电子显微镜（EM），发现小鼠小胶质细胞特异性敲除TDP-43后，出生后早期脑内出现组织结构改变及髓鞘异常。空间转录组学进一步揭示伴有少突胶质细胞（oligodendrocyte, OL）功能障碍相关的干扰素（IFN）应答特征上调。早期耗竭小胶质细胞TDP-43导致成年小鼠运动缺陷。机制上，TDP-43敲除损害小胶质细胞吞噬和降解髓鞘的能力，并引起Tyrobp mRNA中隐蔽外显子（cryptic exon, CE）的插入，产生截短且无功能的DAP12蛋白，从而导致TREM2（Triggering Receptor Expressed on Myeloid cells 2）信号传导缺陷。研究结果表明TDP-43在小鼠中调控TREM2-DAP12轴，揭示了TDP-43调控小胶质细胞功能此前未被识别的新机制。

论文解读：小鼠小胶质细胞TDP-43调控髓鞘精细化修剪及Tyrobp隐蔽外显子抑制

TAR DNA结合蛋白43（TDP-43，由TARDBP基因编码）的核功能缺失及胞质包涵体形成是肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶痴呆（FTD）的核心病理特征，近年也见于阿尔茨海默病（AD）及LATE（Limbic-predominant Age-related TDP-43 Encephalopathy）。既往研究多聚焦于神经元及少突胶质细胞、星形胶质细胞中的TDP-43，小胶质细胞中TDP-43的生理功能和丢失后果鲜有报道。TDP-43作为RNA结合蛋白参与转录调控及选择性剪接，可抑制非保守隐蔽外显子（cryptic exon, CE）的异常插入，此功能在不同细胞类型中具特异性。鉴于小胶质细胞在出生后脑发育、突触修剪及髓鞘异常结构清除中的关键作用，研究人员假设小胶质细胞TDP-43缺失会影响脑早期发育并诱导长期表型，本文在《Nature Neuroscience》发表对此进行探究。

研究人员使用Cx3cr1-Cre^ERT2;Tardbp^fl/fl;Rosa26-LSL-tdTomato小鼠，于出生后第6和8天（P6/P8）他莫昔芬诱导小胶质细胞/巨噬细胞特异性Tardbp敲除（cKO），对照为同窝胎鼠。主要技术方法包括：①免疫磁分选（MACS）及FACS分选原代小胶质细胞与少突胶质细胞（O4⁺）；②7T扩散张量成像（DTI）及基于阈值的簇增强（TFCE）全脑微结构分析；③共聚焦及膨胀显微成像（Expansion Microscopy, 5×）与透射/扫描电镜（EM）定量髓鞘膨出（myelin bulging）、g-ratio及少突胶质细胞线粒体异常；④空间转录组（10x Visium FFPE）联合bulk RNA-seq差异表达与差异外显子使用（DEU, DEXSeq; MAJIQ V3）分析鉴定隐蔽外显子；⑤体外髓鞘碎片（pHrodo标记）吞噬与降解实验、OPC-小胶质细胞共培养及条件培养基分化实验；⑥RT–PCR、Western blot、靶向质谱（Label-Free Quantification, LFQ; MaxQuant/Skyline）检测Tyrobp CE及DAP12蛋白水平；⑦HEK293过表达人TREM2与野生型/含CE的Tyrobp-HA验证SYK磷酸化（pSYK）；⑧P15早期诱导与2月龄成年诱导两组行为学测试（旷场OF、明暗箱、高架十字迷宫EPM、Y迷宫、新物体识别NOR、ledge test、rotarod、悬尾抓握clasping）。

研究结果：

Depletion of TDP-43 alters microglial density and morphology in the postnatal brain（小胶质细胞TDP-43耗竭改变出生后脑中小胶质细胞密度与形态）

P15 cKO小鼠皮层/海马小胶质细胞密度降低，突起总长度、端点数及分支段数减少，细胞体体积增大；CD68⁺吞噬溶酶体平均体积增大但数量减少，电镜下溶酶体结构异常，提示吞噬/降解能力改变。TDP-43蛋白敲减在P12已显现，成年持续。

TDP-43 cKO mice show microstructural brain alterations and aberrant myelin structures（TDP-43 cKO小鼠显示微结构脑改变及异常髓鞘结构）

DTI显示扣带回/运动皮层（RSC/MC）区径向弥散率（RD）与平均弥散率（MD）显著升高。免疫荧光示MBP⁺髓鞘纤维平行一致性下降，总MBP升高，NF200⁺轴突无变化。深皮层层出现更多更大MBP⁺髓鞘膨出（myelin bulging），电镜确认膨出频率增加且小直径轴突髓鞘增厚（g-ratio升高），提示小胶质细胞TDP-43缺失加剧出生后早期髓鞘异常的滞留。

Loss of TDP-43 in microglia leads to defective myelin phagocytosis（小胶质细胞TDP-43缺失致髓鞘吞噬缺陷）

分选小胶质细胞与pHrodo标记髓鞘共孵育，cKO细胞吞噬比例及荧光强度减半；原代小胶质细胞4 h摄取减少，24 h残留降解效率降低。体内三维重建示cKO小胶质细胞内CD68⁺结构中MBP⁺颗粒体积与数量均减少，证实髓鞘吞噬及降解双重受损。

Loss of microglial TDP-43 induces a shift in the ratio between OPCs and mature OLs（小胶质TDP-43缺失引起OPC与成熟OL比例偏移）

RSC/MC与胼胝体cKO小鼠PDGFRα⁺OPC密度降低、CC1⁺成熟OL密度升高，OLIG2⁺Ki67⁺增殖OPC减少；桶状皮层及海马无变化。共培养中KO小胶质细胞降低OPC增殖（Ki67⁺PDGFRα⁺），KO条件培养基促进CC1⁺OL的MBP生成，表明小胶质TDP-43功能影响OPC–OL平衡向成熟偏倚。

IFN-responsive signatures emerge in cKO mice（cKO小鼠出现IFN应答特征）

空间转录组RSC/MC区域差异基因富集抗原呈递（MHC I/II）与IFN响应通路（Ifit3, Irgm1, Stat1, Usp18等）。STAT1⁺CC1⁺OL比例升高，分选O4⁺OL Western blot验证STAT1上调；少突胶质细胞线粒体呈现异常（电子致密包涵物、空泡化、嵴紊乱），提示OL受IFN相关应激。

Microglial TDP-43 represses the expression of a CE in Tyrobp（小胶质TDP-43抑制Tyrobp中隐蔽外显子插入）

Bulk RNA-seq与DEU分析发现4346个差异剪接事件，MAJIQ确认Tyrobp第3–4外显子间67 nt CE在cKO中小鼠小胶质细胞PSI升至11%–14%。RT–PCR见KO出现171 bp含CE条带，qPCR确认CE-Tyrobp升高而总Tyrobp不变。Western blot示cKO小胶质DAP12蛋白显著降低。生物信息学预测CE引入移码提前终止密码子致C端缺失截短蛋白；靶向质谱在TDP-43敲低BV2细胞中检测到截短DAP12（CE-DAP12），经蛋白酶体/溶酶体抑制剂处理后信号增强，证实截短蛋白被快速降解。

CE-containing Tyrobp mRNA contributes to defective DAP12 intracellular signaling（含CE的Tyrobp mRNA致DAP12胞内信号缺陷）

HEK293共转染人TREM2与野生型/含CE Tyrobp-HA：含CE组无全长DAP12蛋白检出（C端抗体不识别截短体），TREM2配体刺激不能诱导SYK磷酸化（pSYK）。原代小胶质细胞髓鞘或TREM2激动剂（4D9）刺激下cKO无pSYK升高，CLEC7A-SYK通路不受影响，证实TREM2-DAP12轴特异性受损。TREM2-KO与DAP12-KO小鼠也见髓鞘膨出增多但大小无差异，提示TDP-43 cKO髓鞘异常不完全由TREM2-DAP12缺陷单独解释。PSVue染色示cKO皮层MBP⁺纤维外露磷脂酰丝氨酸（PS）增加，符合髓鞘清除失败。

TDP-43 cKO mice show anxiety-like behavior and motor deficits when depletion is induced early postnatally（早期产后诱导TDP-43 cKO小鼠表现焦虑样行为与运动缺陷）

P6/P8诱导cKO成年鼠（4月龄）旷场与认知记忆正常，但明暗箱与高架十字迷宫示焦虑样行为，ledge test与rotarod示感觉运动协调及平衡障碍，悬尾抓握（hindlimb clasping）评分升高。2月龄成年诱导敲除仅见clasping异常，无焦虑与运动缺陷，表明发育期小胶质TDP-43缺失对运动及情绪相关皮层微结构具长期影响。

讨论（总结）：

研究人员证实小胶质细胞TDP-43在出生后脑发育中介导髓鞘异常结构的清除（髓鞘精细化），维持OPC/OL平衡及RSC/MC微结构完整性。TDP-43缺失致小胶质细胞Tyrobp mRNA隐蔽外显子异常插入→截短无功能DAP12→TREM2-DAP12信号缺陷→髓鞘吞噬降解受损及髓鞘膨出累积，伴区域特异性OL IFN应激与OPC耗竭。早期（而非成年）小胶质TDP-43缺失足以引起成年小鼠运动协调障碍与焦虑样行为。本研究首次报道小胶质细胞TDP-43通过抑制cryptic exon调控TREM2-DAP12轴，为ALS/FTD等TDP-43蛋白病中胶质细胞功能失调提供新机制视角。局限性包括多基因并行失调未逐一解析、表型区域局限性机制待阐明、小鼠结果需在人源微胶质细胞中验证保守性。