TiO2@GO纳米复合材料对缓症链球菌（Streptococcus mitis）生物膜选择性分布的抑制作用研究

《Results in Surfaces and Interfaces》：Investigating the selective distribution of Streptococcus mitis biofilm by titanium dioxide and graphene oxide-based nanocomposite

　　

缓症链球菌（Streptococcus mitis）是口腔奠基性定植菌，可驱动生物膜形成，依生长状态兼具保护性与致病性。为克服细菌对抗菌药物的耐受性，研究人员正积极开发不杀死细菌而破坏生物膜结构的非杀菌性生物膜分散疗法。维持此类共生菌株的存活至关重要；彻底清除它们会破坏口腔微生态稳态，并诱发致龋病原体引起的严重继发感染。本研究通过溶胶-凝胶辅助水热法合成了TiO2@GO纳米复合材料（Nanocomposite），首次将其应用于通过非致死性界面掩蔽（Interface-masking）途径清除口腔先驱定植菌缓症链球菌（S. mitis）的生物膜。采用结晶紫微孔板法（Crystal Violet Microtiter Plate Assay）评估TiO2@GO纳米复合材料对口腔分离缓症链球菌（S. mitis）的抗生物膜活性，并进一步通过场发射扫描电镜（Field Emission Scanning Electron Microscopy, FE-SEM）在灭菌人牙釉质表面进行验证。与单独使用TiO2或氧化石墨烯（Graphene Oxide, GO）相比，TiO2@GO显著抑制生物膜形成——聚苯乙烯表面孵育8 h后抑制率达约89%，人牙表面孵育24 h后减少约70%。FE-SEM分析证实处理组牙面致密生物膜结构及胞外基质被破坏，而细菌细胞保留正常形态，表明在优化浓度下对浮游菌生长影响有限。这说明TiO2@GO纳米复合材料通过表面掩蔽发挥作用，不对周围微菌群施加非选择性杀菌压力。上述结果表明TiO2@GO纳米复合材料可通过表面活性机制有效抑制缓症链球菌（S. mitis）生物膜形成，支持基于纳米复合材料的靶向口腔生物膜控制策略的进一步探索。

论文解读：TiO₂@GO纳米复合材料对缓症链球菌（Streptococcus mitis）生物膜选择性分布的抑制作用研究

研究背景与意义

口腔链球菌（Oral Streptococci）占口腔微生物群50%以上，其中缓症链球菌（Streptococcus mitis，S. mitis）属Mitis族，是早期定植于牙面的先驱菌（Pioneer Colonizer），可通过竞争排斥致龋菌（如变形链球菌 Streptococcus mutans）及调节宿主免疫维持口腔健康，但其过度形成生物膜亦可引发牙周病、感染性心内膜炎等。传统抗菌剂以杀菌为目的，易导致微生态失调及细菌耐药；生物膜胞外聚合物基质（Extracellular Polymeric Substance, EPS）更使最低抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration, MIC）较浮游菌升高10～103倍。因此，开发不杀伤共生菌、仅干扰其黏附与生物膜成熟的非杀菌性（Non-bactericidal）表面修饰材料成为研究热点。二氧化钛（Titanium Dioxide, TiO₂）纳米颗粒具表面反应性及化学稳定性，可调控细菌附着，但易在水相中团聚降低效能；氧化石墨烯（Graphene Oxide, GO）具二维片层结构、高比表面积及含氧官能团，可通过表面掩蔽（Surface Masking）抑制黏附且毒性较低。二者复合有望协同提升分散度与抗生物膜性能。本研究首次将TiO₂@GO纳米复合材料作为牙面生物膜阻遏剂应用于S. mitis，探讨其通过界面掩蔽抑制先驱菌生物膜形成的效果与机制，为保留微生态的口腔护理策略提供实验依据。本文发表于《Results in Surfaces and Interfaces》。

主要技术方法概述

研究人员自10名健康志愿者晨起未刷牙口腔龈沟拭子分离培养S. mitis，经革兰染色、生化试验初筛后通过16S rRNA基因PCR扩增及BLAST比对确证种属并提交GenBank（登录号PP593740、PP593741）。TiO₂纳米球采用溶胶-凝胶（Sol-gel）法制备，TiO₂@GO纳米复合材料通过GO水分散液与TiO₂悬液搅拌后水热法（Hydrothermal Method，403 K，12 h）耦合合成。采用场发射扫描电镜（Field Emission Scanning Electron Microscope, FE-SEM）、能谱仪（Energy Dispersive X-ray Spectroscopy, EDX）、傅里叶变换红外光谱（Fourier Transform Infrared Spectroscopy, FTIR）及紫外-可见吸收光谱（UV-Vis Spectroscopy）对材料形貌、元素组成及化学相互作用进行表征。通过微量肉汤稀释法测定MIC确定处理浓度（0.125 mg/mL，即125 μg/mL），采用结晶紫微孔板法（Crystal Violet Assay）定量检测聚苯乙烯表面S. mitis生物膜形成及TiO₂、GO、TiO₂@GO各组的抑制率，并在灭菌人牙片表面培养S. mitis后固定、梯度脱水、喷金，以FE-SEM观察纳米复合材料处理前后生物膜及EPS超微结构变化。

研究结果

3.1. Characterization of TiO₂@GO

FE-SEM显示TiO₂呈150–250 nm球状颗粒，GO呈典型褶皱片层，TiO₂@GO中TiO₂颗粒均匀负载于GO片层上；EDX证实含Ti（52.79%）、C（9.06%）、O元素且元素映射分布均匀；FTIR中TiO₂@GO的Ti–O特征峰较纯TiO₂减弱，提示TiO₂与GO表面含氧基团间存在相互作用；UV-Vis显示TiO₂@GO在220–250 nm处吸光度高于单一组分，表明复合成功且光吸收增强。

3.2. Isolation and identification of Streptococcus mitis from human oral cavity

自10名志愿者拭子初筛获得6株疑似链球菌，经溶血及生化鉴定确认4株为S. mitis，其中2株（编号3B、3CD）为中等生物膜形成者（Moderate Biofilm Former, MBF）纳入后续实验。

3.3. Identification of S. mitis isolates by 16S rRNA gene sequence analysis

两株候选菌16S rRNA序列与GenBank中S. mitis模式株同源性最高，确认为S. mitis，序列已入库（PP593740、PP593741）。

3.4. Assessment of biofilm formation

四株S. mitis在聚苯乙烯板12、24、48 h培养后均无强生物膜形成株（SBF）；3B与3CD在12 h及48 h显示为中等生物膜形成能力，被选作实验菌株。

3.5. Assessment of biofilm inhibition

以1 mg/mL各材料处理，TiO₂@GO（含2% GO为最优配比）在聚苯乙烯表面作用8 h对S. mitis 3B及3CD生物膜抑制率分别达约89%与相近水平，显著高于单独TiO₂（约78.84%）或GO（约86%），且抑制率随孵育时间延长呈渐进上升趋势；表明GO阻止TiO₂团聚扩大活性界面，复合体对早期定植干扰优于单一组分。

3.6. FESEM analysis of the biofilm reduction on human teeth

未处理人牙片表面S. mitis形成致密多层细胞及丰富EPS基质；TiO₂@GO处理组牙面仅见少量散在、形态正常的单个菌体，几无EPS及菌间连接结构（Nanotubes缺失），证实复合材料在接近临床的人牙表面上通过破坏EPS沉积与细胞聚集实现生物膜分散，同时菌体形态完整提示非杀菌性作用。

讨论与结论总结

讨论指出S. mitis具共生与条件致病双重属性，理想控菌斑策略应阻断其生物膜成熟而非清除菌种本身。TiO₂@GO中GO片层作为分散骨架防止TiO₂团聚，复合体通过物理掩蔽牙釉质纳米粗糙度、电荷分布及唾液获得性膜（Salivary Acquired Pellicle）黏附位点，辅以亚致死水平活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）局部微扰，阻碍S. mitis由浮游态向固着态转换及EPS合成信号通路，从而抑制先驱菌启动复杂多菌种菌斑分层结构，且保留共生菌活力避免微生态失调（Dysbiosis）。与依赖离子毒性杀菌的现有纳米抗菌剂相比，该"大分子毯"（Macromolecular Carpet）表面掩蔽范式在S. mitis上获89%生物膜清除率且MIC为125 μg/mL，具较高应用潜力，但ROS定量、接触角、Zeta电位及黏附力直接测定尚需后续研究。

结论：研究人员证实TiO₂@GO纳米复合材料可有效抑制缓症链球菌（Streptococcus mitis）生物膜形成而对细菌生长影响极小，降低破坏有益口腔微菌群风险；FE-SEM显示其显著削减牙面生物膜架构及胞外基质积累。TiO₂@GO主要通过表面与界面介导机制发挥抗生物膜作用——GO掩蔽细菌黏附位点，TiO₂改变局部界面环境，共同限制细菌附着与生物膜成熟，是一种具前景的非杀菌性口腔生物膜控制策略。