综述：通过单细胞RNA测序揭示肿瘤异质性：从基本考量到临床应用

《Seminars in Cancer Biology》：Unveiling tumor heterogeneity by single cell RNA-sequencing: From basic considerations to clinical applications

　　

肿瘤异质性——涵盖多样的细胞表型、基因组改变和微环境背景——是有效癌症治疗的主要障碍。单细胞RNA测序(scRNA-seq)通过在单细胞分辨率下捕获转录组，改变了研究人员解决这一复杂性的能力。在此，研究人员综述了高质量scRNA-seq研究所需的技术基础。随后追溯了scRNA-seq平台从手动显微操作到高通量系统的演变，并描述了实现可靠数据解释的计算流程。scRNA-seq的应用以肺癌为例进行了展示，其中单细胞分析揭示了(i)肿瘤的克隆和亚克隆结构，(ii)免疫微环境的广泛重塑，(iii)对靶向药物和免疫检查点阻断(immune-checkpoint blockade)产生耐药的关键机制，以及(iv)新抗原特异性T细胞(T-cell)反应的动力学。将机器学习技术——如深度学习分类器(deep-learning classifiers)和基于图的模型——与单细胞转录组数据相结合，显著加速了生物标志物发现，产生了更准确的风险分层评分，并实现了患者特异性治疗预测的生成。研究人员调查了主要试验注册库ClinicalTrials.gov，并确定了～380项正在进行的或已完成的研究，这些研究明确将scRNA-seq作为相关性或药效学终点纳入。总体而言，分析显示scRNA-seq正在成为现代试验中越来越重要的组成部分，提供高分辨率的细胞和分子读数，补充了传统的影像学和混合组学(bulk-omics)终点。尽管仍存在关键挑战，包括成本、可扩展性以及在常规临床部署前需要严格验证，但持续的技术进步正在不断扩展scRNA-seq作为精准医学基石的潜力。

**1. 引言(Introduction)**
理解肿瘤生物学的复杂性已成为现代癌症研究的焦点。肿瘤表现出显著的异质性，包括多样的细胞组成、动态的细胞间相互作用以及随时间演变的能力。单细胞技术，尤其是单细胞RNA测序(scRNA-seq)，使研究人员能够以前所未有的分辨率探索这种肿瘤间和肿瘤内多样性。scRNA-seq通过捕获单个细胞的转录组，提供了传统批量RNA测序方法无法实现的细胞异质性全景视图。该技术能够识别肿瘤内不同的细胞状态、免疫反应和潜在治疗靶点。人类细胞图谱(HCA)等国际项目为癌症研究人员提供了健康与疾病组织中细胞多样性的综合框架，支持新生物标志物和治疗靶点的发现。scRNA-seq研究的发表数量急剧增长，其中免疫学和癌症医学是最具代表性的领域，而生物标志物发现和神经科学等新兴领域也日益重要。在肺癌中，单细胞方法正被越来越多地纳入诊断、治疗、监测和预后的研究，逐渐产生临床相关性。

**2. 单细胞和单核测序实验的样本制备与技术考量(Sample preparation and technical considerations for single-cell and single-nuclei sequencing experiments)**
传统批量RNA测序平均了混合细胞群中的基因表达，掩盖了细胞特异性差异。而scRNA-seq能够揭示如黑色素瘤中不同基因表达谱的肿瘤、免疫和基质细胞亚群。实验设计对数据质量和可解释性至关重要。起始材料的保存状态是关键：新鲜组织因RNA和DNA完整性高而首选，但临床限制常需使用新鲜冷冻(FF)或福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)标本。FFPE样本的RNA提取和测序方法近来取得进展，提高了单核测序的可行性。组织解离需温和以维持细胞活力，酶消化可能引入转录伪影，机械解离产量较低。实验设计应纳入多个生物学重复以处理患者间变异，并从肿瘤不同区域取样以揭示克隆结构。全细胞悬液提供肿瘤微环境(TME)的全面概览，但可通过荧光激活细胞分选(FACS)或磁珠分离富集特定细胞群。PERFF-seq技术允许在FF和FFPE样本中进行RNA导向的稀有细胞状态富集。质量控制(QC)需在样本和文库制备阶段进行，如细胞活力>80%、cDNA大小400 bp-10 kb、最终文库大小400-500 bp。批次效应需通过严格实验设计和标准化方案最小化，并确保样本间测序深度平衡。

**3. scRNA-seq技术的演变(Evolution of scRNA-seq techniques)**
单细胞测序技术的关键区别在于细胞分离和核酸的唯一条形码分配。最初基于手动方法，如显微操作，适用于少量细胞。随后出现中等通量技术，如SMART-Seq结合流式细胞术或Fluidigm C1平台，可分析数百至数千个细胞。高通量平台如BD Rhapsody(微孔)和10xGenomics(液滴)可并行分析数万个细胞，但存在低丰度转录本检测困难和双细胞率较高的问题。最新无仪器方法如PIP-seq和基于平板的split-pool条形码方法使更多实验室能采用scRNA-seq。新型半透膜胶囊(SPC)技术为多模态单细胞组学提供了可扩展基础。在转录本捕获方面，3'和5'方法通过模板转换生成全长cDNA，随后片段化并扩增末端片段；SMART-seq保留全长覆盖。其他方法包括用于免疫细胞克隆型分析的全长V(D)J区域测序、针对预定基因面板的靶向scRNA-seq、用于样本多重化的细胞散列(cell hashing)、以及CITE-seq同时测量表面蛋白和转录组。scRNA-seq已整合到CRISPR筛选工作流中，将gRNA与转录组关联以研究基因调控。与空间转录组学的结合有望揭示细胞在组织中的空间定位和相互作用。单细胞DNA测序(scDNA-seq)可分析基因组变异，包括体细胞突变和拷贝数变异(CNV)，如初级模板定向扩增(PTA)技术可恢复超过95%的单细胞基因组。生物信息学分析是多步骤流程，包括预处理(质量控制、过滤、去除环境RNA)、降维可视化(PCA、t-SNE、UMAP)、聚类、细胞类型鉴定、差异表达分析、轨迹推断。常用软件包有Bioconductor、Seurat、Scanpy。批次效应校正工具如Harmony、MNN、SCIBER；双细胞检测工具如scDblFinder、DoubletFinder、Scrublet。标准化、严格实验设计和生物信息学分析对获得可靠结果至关重要。

**4. 单细胞测序揭示肿瘤细胞和肿瘤微环境异质性(Single-cell sequencing to uncover tumor cell and tumor microenvironment heterogeneity)**
单细胞测序技术(scDNA-seq和scRNA-seq)揭示了肿瘤异质性，包括肿瘤间和肿瘤内异质性(ITH)。scDNA-seq可识别亚克隆群体并绘制克隆进化，如乳腺癌中的CNV分析。算法如inferCNV、SCEVAN和Numbat进一步改进了CNV检测。scRNA-seq与scDNA-seq整合提供了异质性全貌：例如结直肠癌研究中发现随时间推移遗传异质性降低而转录异质性增加，表明肿瘤细胞通过基因表达变化适应环境压力。肿瘤微环境(TME)包含免疫细胞、基质、血管和细胞外基质。scRNA-seq和空间转录组学揭示了TME的细胞表型和空间组织：乳腺癌中肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)的可塑性、骨肉瘤中新辅助化疗诱导的肿瘤相关成纤维细胞(CAF)和免疫细胞重编程、直肠癌放化疗后免疫和基质重塑、肾细胞癌转移中的基质和免疫细胞变化、乳腺癌从导管原位癌(DCIS)到浸润性导管癌(IDC)进展中的免疫微环境变化。成纤维细胞(CAF亚群)成为肿瘤行为的关键调控者。计算方法如PyClone、SCITE、Monocle、Clonealign、sc-linker能够从测序数据推断克隆结构和进化轨迹，识别肿瘤脆弱性，并设计个性化治疗方案。

**5. 单细胞RNA测序在肺癌患者中的临床应用(Clinical applications of scRNA-seq in lung cancer patients)**
单细胞技术通过描绘肿瘤的遗传和转录景观，可改善疾病进展预测、监测治疗期间的免疫和肿瘤细胞动态、识别治疗靶点并制定个性化治疗策略。主要应用方向包括：肿瘤微环境异质性监测、生物标志物发现、新抗原特异性T细胞监测和人工智能应用。

**5.1. 监测肺癌中的肿瘤微环境异质性(Monitoring TME heterogeneity in lung cancer)**
肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)的统称。NSCLC的两种主要亚型——腺癌(LUAD)和鳞状细胞癌(LUSC)在TME方面差异显著：LUAD富集CD8⁺细胞毒性T细胞和M1样巨噬细胞，而LUSC以中性粒细胞、M2巨噬细胞和调节性T细胞(Tregs)为特征。Wu等人对晚期NSCLC的scRNA-seq分析揭示了免疫抑制性巨噬细胞亚群、CD8⁺耗竭T细胞和Tregs与免疫检查点阻断(ICB)不良反应相关。LUAD显示更活跃的免疫微环境，包括更高的HLA-I/II表达和树突状细胞抗原呈递能力。对免疫治疗有反应者富集活化细胞毒性T细胞和促炎巨噬细胞，无反应者则富集免疫抑制性髓系和淋巴样群体。新的生物标志物如T细胞受体(TCR)克隆性、TIL空间分布和耗竭标志物(PD-1、TIM-3)正在探索中。Leader等人发现了一种免疫激活标志Lung Cancer Activation Module (LCAM^hi)，由PD-L1⁺CXCL13⁺CD8⁺ T细胞、IgG⁺浆细胞和SPP1⁺巨噬细胞组成，与抗PD-L1治疗的良好反应相关，独立于肿瘤突变负荷。Tian等人在SCLC中观察到免疫细胞浸润和激活状态的瘤内变异，表明免疫逃逸机制可能与NSCLC不同。

**5.2. 使用scRNA-seq进行预后和预测性生物标志物发现(Prognostic and predictive biomarker discovery using scRNA-seq)**
Maynard等人对接受EGFR和ALK靶向治疗的NSCLC患者进行了纵向scRNA-seq监测。发现残留病(RD)细胞呈现肺泡再生细胞状态，而治疗中进展(PD)细胞上调色氨酸-犬尿氨酸通路、纤溶酶原活化和间隙连接信号，这些通路与免疫逃逸和肿瘤进展相关。Kim等人分析了转移性LUAD的208,000多个细胞，识别出一种在转移灶中占主导地位的不同于正常分化轨迹的癌细胞亚型，伴随组织驻留髓系细胞被单核细胞来源巨噬细胞和树突状细胞取代，以及T细胞耗竭增加。另一项研究通过scRNA-seq分析LUAD化疗前后样本，发现化疗下调原发肿瘤中的关键致癌通路但未能激活转移灶中的代偿性通路。一项整合scRNA-seq和批量RNA-seq及全外显子组测序的研究揭示了LUAD的四种分子亚型，其中MS4亚型与免疫抑制和预后不良相关，并鉴定CDC25C为潜在预后生物标志物，其高表达与肿瘤细胞侵袭、迁移和上皮间充质转化(EMT)相关。研究者还开发了包含19个程序性细胞死亡通路和细胞器功能相关基因的23基因多组学预后特征，通过整合scRNA-seq和深度神经网络，可有效进行风险分层并预测吉西他滨和PD-1抑制剂的治疗效果。

**5.3. 监测新抗原特异性T细胞用于过继性T细胞转移和CAR T细胞疗法(Monitoring neoantigen-specific T cells for adoptive T cell transfer and CAR T cell therapies)**
过继细胞疗法(ACT)通过输注体外扩增的T淋巴细胞增强效应细胞池。scRNA-seq加速了功能性TCR的发现。Hanada等人发现CD39和CXCL13的表达标志可可靠区分新抗原反应性T细胞。一项Ib期临床试验将个性化新抗原疫苗与抗PD-1疗法联合应用于黑色素瘤、NSCLC和膀胱癌患者，证明可行、安全并能诱导强效新抗原特异性T细胞反应。Ma等人引入了一种基于RNA预扩增的单细胞测序快速鉴定肿瘤反应性TCR的方法。Ingels等人报道在新抗原靶向树突状细胞疫苗接种的肺癌患者中产生了跨越整个分化谱的长寿命T细胞。Caushi等人结合scRNA-seq和TCR测序研究抗PD-1治疗肺癌中新抗原特异性肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的转录程序，发现新抗原特异性TILs具有独特的基因表达模式，其特征是T细胞活化和细胞毒性基因表达增加，且抗PD-1治疗增强了这些TILs的扩增和功能，与总体生存率和治疗反应相关。嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法在血液恶性肿瘤中取得显著成效，并正在扩展到实体瘤如肺癌。Hu等人利用scRNA-seq解析靶向T细胞恶性肿瘤的相残CAR T细胞的存活机制，揭示不同的CAR⁺ T细胞转录状态(耗竭、增殖、效应表型)。Srivastava等人证明免疫原性化疗与免疫检查点阻断联合可增强CAR T细胞的招募和抗肿瘤活性。Yaga等人将CD98重链(CD98hc)确定为NSCLC中有希望的CAR T靶点。

**5.4. 人工智能在scRNA-seq数据分析中用于转化肿瘤学(Application of artificial intelligence in scRNA-seq data analysis for translational oncology)**
人工智能(AI)技术，特别是机器学习(ML)，被广泛用于scRNA-seq数据分析，包括基因表达缺失值插补、批次效应去除和细胞类型鉴定。自动编码器(Autoencoders)用于特征提取和降噪；图神经网络(GNNs)利用细胞关系图结构改进聚类和分类；生成对抗网络(GANs)用于增加合成数据以增强模型鲁棒性。然而，深度生成框架如scVI的插补值仍是统计期望，过度降噪可能引发假阳性。深度生成整合器如TotalVI和MultiVI可融合RNA与蛋白质或染色质可及性数据，但可能使RNA组分主导潜在空间。深度学习驱动的细胞间通讯(CCC)框架如基于GCN的CellChat和基于VAE的DeepSignal提供了考虑空间邻近或下游转录反应的上下文感知交互分数，但其依赖不完全的配体-受体数据库且缺乏正交扰动验证。在肺癌研究中，Zhang等人通过机器学习分析LUAD的scRNA-seq数据，识别出与临床结局相关的上皮亚群和免疫细胞状态，发现SFTPB和AGER等新预后标志物。Cheng等人开发了基于scRNA-seq特征的诊断和预后模型，准确预测患者生存和免疫治疗反应，并将免疫耗竭标志物和功能障碍T细胞状态识别为不良反应指标。Ji等人构建了基于细胞焦亡和铁死亡的风险模型，识别出具有高焦亡活性的树突状细胞和中性粒细胞，并建立了包括CXCL2和IFNG的七基因特征与IL-17信号相关。Xu等人发现表达MHC II类分子和共刺激分子的抗原呈递肿瘤相关成纤维细胞(apCAFs)与免疫检查点抑制剂良好反应相关。通过整合scRNA-seq、全基因组关联研究(GWAS)和贝叶斯解卷积，揭示了LUAD进展和耐药性的细胞类型特异性遗传驱动因子，如SLC2A1。但多数研究仍依赖内部交叉验证，缺乏独立验证和前瞻性临床试验。

**6. 单细胞RNA测序作为临床试验的新兴组成部分(Single-Cell RNA sequencing as an emerging component of clinical trials)**
在ClinicalTrials.gov上对涉及单细胞测序的临床研究进行了综合分析，发现383项研究使用了scRNA-seq。其中212项关注非癌症研究，171项调查各种癌症状况。应用包括TME和免疫细胞表征、新技术开发、治疗干预引起的分子变化分析、组织特异性细胞类型异质性解析、疾病机制阐明和生物标志物发现。研究设计分为观察性和干预性，后者主要评估药物疗效，scRNA-seq用于深入阐明分子和细胞后果。地理分布上，中国占据主导(134项)，其次是欧盟(105项)和美国(80项)。过去十年单细胞测序试验数量显著增加，过去四年活跃和招募中的研究激增。

**7. 结论与展望：局限性与机遇(Concluding remarks: limitations and opportunities)**
scRNA-seq已成为多组学格局的固有组成部分，能够揭示细胞异质性、细胞间相互作用和细胞状态。通过与ATAC-seq、代谢组学、蛋白质组学、16S RNA测序、CRISPR基因编辑、长读长测序和空间图谱等补充组学技术整合，研究人员可从分类观察转向机制性解释复杂疾病如癌症。主要局限性包括：通常仅分析样本中一小部分细胞，可能遗漏稀有细胞群或亚克隆群体；多区域测序和空间转录组学正在克服此局限。将scRNA-seq转化为常规临床实践面临技术、分析、监管和经济障碍：高维数据需凝练为可操作的临床报告；FFPE兼容方案需系统基准测试；标准化生物信息学流程和监管途径需建立；报销模式、临床医生培训和结果发现的伦理框架待确定。尽管存在成本、可扩展性和标准化挑战，持续创新和验证将为其在转化研究、临床试验和常规患者管理中的使用铺平道路，最终改善患者预后。