经皮耳廓迷走神经刺激在模拟溃疡性结肠炎和克罗恩病的两种临床前模型中对上皮屏障完整性和肠道通透性的上下文依赖性调节：一项描述性分析

《International Journal of Molecular Sciences》：Context-Dependent Modulation of Epithelial Barrier Integrity and Intestinal Permeability by Transcutaneous Auricular Vagus Nerve Stimulation in Two Preclinical Models Mimicking Ulcerative Colitis and Crohn’s Disease: A Descriptive Analysis

　　

炎症性肠病（IBD），包括溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD），与迷走神经活动降低和屏障功能受损相关。经皮耳廓迷走神经刺激（taVNS）在急性结肠炎中显示出预防效果，但其对肠道屏障完整性的影响尚不清楚。为评估这一点，研究人员在诱导结肠炎前对C57BL/6雄性小鼠进行taVNS（10 V，20 Hz，500 μs，10 min）。使用5%葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导UC样结肠炎120小时，并每日进行taVNS，而CD样结肠炎通过直肠内给予二硝基苯磺酸（DNBS，4 mg）溶于30%乙醇诱导，在诱导期间及之后48小时进行taVNS。TaVNS以稳态方式减少非结肠炎小鼠以及DNBS结肠炎小鼠的结肠增殖，并增强分化。它在非结肠炎条件下减少肠内分泌细胞，但在DSS结肠炎小鼠中未减少，并在DSS和DNBS组中减少簇细胞。TaVNS在DSS结肠炎中增加MUC2，在DNBS对照组中减少TFF3。它在DSS对照组中减少Lgr5⁺干细胞，但在DSS结肠炎期间维持它们，而HOPX⁺干细胞在非结肠炎DSS条件下减少，胎儿样干细胞保持不变。疾病活动指数（DAI）与嗜铬粒蛋白A（CgA）呈负相关。TaVNS阻止了DSS结肠炎小鼠远端结肠的旁细胞通透性增加，增加了远端DSS对照组和近端结肠炎结肠的跨上皮电阻（TEER），并在非结肠炎DSS条件下增强了近端结肠的离子转运。总体而言，taVNS对上皮组成和屏障功能的影响是上下文和模型依赖性的。

炎症性肠病（IBD），包括溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD），与迷走神经（VN）活动降低及肠道屏障功能受损密切相关。经皮耳廓迷走神经刺激（taVNS）作为一种非侵入性神经调控手段，在急性结肠炎中显示出抗炎潜力，但其对肠道上皮屏障完整性的具体影响尚不明确。为此，研究人员利用两种临床前小鼠模型——葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的UC样急性结肠炎模型和二硝基苯磺酸（DNBS）诱导的CD样结肠炎模型，系统评估了预防性taVNS对结肠上皮增殖、分化、干细胞动态、分化上皮细胞亚群及屏障功能的影响。该研究发表在《International Journal of Molecular Sciences》。

主要关键技术方法包括：使用C57BL/6雄性小鼠（来源：Central Animal Care Services或Charles River）建立DSS（5% w/v，120 h）和DNBS（4 mg/鼠，溶于30%乙醇，直肠给药）肠炎模型；taVNS参数为10 V、20 Hz、500 μs脉冲宽度、30 s通断间隔、总时长10 min，每日麻醉下进行；通过免疫荧光（IF）染色定量各标记物的平均积分密度（MID）；利用Ussing chamber测定跨上皮电阻（TEER）、旁细胞通透性（FITC-葡聚糖4 kDa）及药物诱导的离子转运活性（短路电流I_SC）；采用qRT-PCR检测mRNA表达；使用Spearman秩相关分析疾病活动指数曲线下面积（DAI-AUC）与IF标记物的相关性。

研究结果如下：

**2.1 taVNS对DSS结肠炎模型中结肠增殖和分化细胞的影响**：通过IF检测Ki67（增殖标记）和CK20（分化标记）发现，taVNS在非结肠炎小鼠中减少Ki67的MID，但未改变结肠炎小鼠的Ki67；taVNS增加非结肠炎和小鼠DSS结肠炎条件下的CK20 MID，并防止DSS诱导的CK20下降。

**2.2 taVNS对DSS结肠炎模型中分化上皮细胞（肠内分泌细胞、簇细胞、杯状细胞）相关标记的影响**：taVNS在非结肠炎小鼠中减少CgA（肠内分泌细胞标记）的MID，并在DSS结肠炎小鼠中维持CgA；taVNS在非结肠炎小鼠中减少DCLK1（簇细胞标记）的MID，但对结肠炎小鼠无影响；taVNS在DSS结肠炎小鼠中增加MUC2（杯状细胞标记）的MID，但未改变Muc2 mRNA；TFF3（杯状细胞相关标记）的MID在各组间无显著变化。

**2.3 taVNS对DSS结肠炎模型中结肠增殖性、胎儿样和静息干细胞的影响**：taVNS在非结肠炎小鼠中减少Lgr5⁺增殖性干细胞的MID和mRNA，在DSS结肠炎小鼠中维持Lgr5 mRNA水平；Ly6a⁺胎儿样干细胞无显著变化；taVNS在非结肠炎小鼠中减少HOPX⁺静息干细胞的MID，但对结肠炎小鼠无影响。

**2.4 DSS结肠炎模型中DAI-AUC与上皮细胞标记MID的相关性**：Spearman分析显示，DAI-AUC仅与CgA的MID呈显著负相关（r = ?0.6732，p = 0.0073），与Ki67、CK20、MUC2、DCLK1无显著相关。

**2.5 taVNS对DSS结肠炎模型中远端和近端结肠的旁细胞通透性、TEER及药物诱导的离子转运活性的影响**：Ussing chamber实验显示，在近端结肠，taVNS增加DSS结肠炎小鼠的TEER，并在非结肠炎条件下增强对阿米洛利、IBMX、福司柯林、卡巴胆碱和布美他尼的离子转运反应；在远端结肠，taVNS增加非结肠炎小鼠的TEER，并在DSS结肠炎小鼠中显著降低120分钟时FITC-葡聚糖通量（p = 0.0503，接近显著），但未改变离子转运活性。

**2.6 taVNS对DNBS结肠炎模型中结肠增殖和分化细胞的影响**：taVNS在非结肠炎和DNBS结肠炎小鼠中均减少Ki67的MID，并增加CK20的MID。

**2.7 taVNS对DNBS结肠炎模型中分化上皮细胞标记的影响**：taVNS在非结肠炎小鼠中减少CgA的MID，但在DNBS结肠炎小鼠中无影响；taVNS在非结肠炎和结肠炎小鼠中均减少DCLK1的MID；MUC2的MID和mRNA无变化；taVNS在非结肠炎小鼠中减少TFF3的MID，但结肠炎小鼠中无变化。

**2.8 taVNS对DNBS结肠炎模型中结肠增殖性、胎儿样和静息干细胞的影响**：taVNS对Lgr5⁺、Ly6a⁺和HOPX⁺干细胞的MID和mRNA均无显著影响。

**2.9 DNBS结肠炎模型中DAI-AUC与上皮细胞标记MID的相关性**：未发现DAI-AUC与Ki67、CK20、TFF3、CgA、DCLK1的MID之间存在显著相关性。

讨论部分总结：taVNS对肠道上皮屏障完整性的影响呈现模型、上下文和区域依赖性。在稳态条件下，taVNS发挥稳态调节作用，下调不必要的增殖和干细胞活性；在DSS结肠炎中，taVNS通过维持Lgr5⁺干细胞池、增加MUC2表达、保护CgA阳性肠内分泌细胞及改善TEER和旁细胞通透性，促进上皮修复；而在DNBS结肠炎中，taVNS主要减少增殖并促进分化，但对干细胞池无显著影响。CgA与DAI的负相关提示肠内分泌细胞在taVNS的预防效果中发挥关键作用。研究结论翻译如下：总之，研究人员的发现表明，taVNS对肠道屏障完整性和上皮离子转运活性的预防性影响是模型、上下文和区域依赖性的。尽管taVNS在UC样和CD样结肠炎模型中均增加了肠细胞分化，但其对干细胞和分化结肠上皮细胞（CEC）的影响是模型依赖性的，这应在未来关注taVNS预防性效果的研究中予以考虑。研究人员还表明，taVNS可能改变CEC分化，有利于DSS结肠炎中的上皮谱系（如肠内分泌细胞）。肠内分泌细胞与DSS模型中的DAI呈强负相关，提示这些细胞与taVNS对DAI的预防作用之间存在联系。在非结肠炎条件下，taVNS下调结肠增殖活性和干细胞池以及一些特定分化CEC，表明taVNS的上下文依赖性。为更好理解taVNS对CEC和干细胞的影响，未来的功能研究应评估与taVNS或其介质相关的分子通路在每种CEC和干细胞亚群中的潜在修饰。此外，未来研究应评估taVNS在已建立的结肠炎模型中的治疗潜力。