《International Journal of Molecular Sciences》：The Synergistic Neuroprotective Effect of Honokiol and Magnolol Against Amyloid-β and MPP+-Induced Neurotoxicity in SH-SY5Y Cells: An Antioxidant, Molecular Orbital, and ADMET Study
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使用基因修饰的自体造血干细胞（hematopoietic stem cells, HSCs）的基因修饰造血干细胞疗法在过去30年中已发展成为一种替代方法，以规避同种异体造血细胞移植（allogeneic hematopoietic cell transplan
使用基因修饰的自体造血干细胞（hematopoietic stem cells, HSCs）的基因修饰造血干细胞疗法在过去30年中已发展成为一种替代方法，以规避同种异体造血细胞移植（allogeneic hematopoietic cell transplantation）相关的供体可用性限制、过度方案相关毒性风险、长期免疫抑制和移植物抗宿主病。基于病毒将转基因插入宿主基因组的基因替代疗法（gene replacement therapy）被开发为自体细胞基因修饰的主要方法之一。不幸的是，许多肿瘤发生（oncogenesis）案例直接由基因修饰造血干细胞疗法引起。本综述的目的是描述造血干细胞基因替代疗法中白血病发生（leukemogenesis）的案例，阐明其原因，并概述风险缓解策略。旨在阐明造血干细胞基因替代疗法中的主要风险因素。插入性诱变（insertional mutagenesis）导致原癌基因（proto-oncogenes）激活，主要是LMO2和MECOM-EVI1。γ-逆转录病毒载体（γ-retroviral vectors）在这种情况下是危险的，因为它们包含具有强启动子活性的长末端重复序列（long terminal repeats, LTRs），并且倾向于在转录起始位点附近整合。因此，开发了更安全的自失活慢病毒载体（self-inactivating lentiviral vectors），其长末端重复序列经过修饰以降低其启动子活性，并具有更安全的整合模式。然而，白血病发生的风险仍然存在，因为整合到转基因表达盒中的启动子可能仍会影响邻近基因的表达。另一个风险因素是单体7（monosomy 7），无论是预先存在的还是由MECOM-EVI1激活引起的，都可能直接导致白血病发生。因此，造血干细胞（HSPC）基因替代疗法中的肿瘤发生没有单一确定原因；相反，多种因素可能共同作用，每个因素在特定条件下都可能是充分的。
1. Introduction
基因替代疗法（gene replacement therapy）是一种针对遗传病病因的直接治疗方法。在过去十年中，特别是离体造血祖干细胞（hematopoietic progenitor stem cells, HPSCs）的基因替代疗法取得了重大进展。HPSCs是主要位于骨髓中的特化祖细胞，通过称为造血作用（hematopoiesis）的过程产生所有血细胞类型，具有自我更新和多能性两个关键特性。同种异体HPSC移植是治疗多种代谢紊乱、先天性免疫缺陷、溶酶体贮积症和血红蛋白病（hemoglobinopathies）的标准方法，但需要合适的供体，并存在移植物抗宿主免疫反应的风险。移植物抗宿主病（graft-versus-host disease）是同种异体造血细胞移植高成本和发病率的主要因素，还与10-30%的移植相关死亡率相关（因复发、器官衰竭和感染）。因此，对自体HPSCs进行遗传修饰的方法极为可取。基因替代疗法最常见的变体之一基于逆转录病毒载体（retroviral vectors，γ-逆转录病毒或慢病毒载体），这些载体能够将所需的转基因插入宿主基因组。不幸的是，许多肿瘤发生案例直接由基于病毒载体的基因修饰造血干细胞疗法引起，这与基因治疗载体的设计直接相关。基于HPSC的基因替代疗法的主要目的是永久性地改变祖细胞中的基因表达，这可能产生具有异常原癌基因表达潜力的细胞谱系，导致高致癌风险，尤其是与不分裂细胞或瞬时表达相比。逆转录病毒基因治疗与白血病之间的联系是该领域历史上的重大挫折，但也为科学家提供了宝贵的教训，从而促进了当今更安全的疗法。目前可用的基因疗法中，白血病发生的风险仍然是一个活跃的关注点。新基因疗法的设计必须考虑该领域的进展，以遵循当前最佳安全标准。在批准的市售基因疗法中观察到白血病案例，临床实验中也观察到了肿瘤发生的案例，包括表1中疗法的实验，但提供了更详细的图景。目前批准的疗法大多基于慢病毒载体，但这是基于先前γ-逆转录病毒载体经验的最新发展。HPSCs的另一种遗传修饰方法是CRISPR/Cas基因组编辑（genome editing）。与逆转录病毒基因插入相比，它保留了正常的基因拷贝数以及上下游基因组背景。然而，这种方法不允许插入大序列，只能对现有基因组位点进行微小编辑（替换、插入或缺失）。在基因拷贝完全丢失或发生大缺失的情况下，这一特性阻止了CRISPR/Cas的使用。它优选用于破坏功能性基因组位点，如Casgevy的情况，而不是创造新功能。本综述旨在阐明使用逆转录病毒载体的基因替代疗法的风险因素，其中一些已成功解决，另一些仍然存在。综述第一部分描述了病毒载体、其发展的复杂历史及其安全性的进步。第二部分描述了与细胞治疗相关的预处理（conditioning）及其在白血病发生中的作用。
2. γ-Retroviral and Lentiviral Vectors and Their Role in Oncogenesis
早期成功的疗法使用修饰的γ-逆转录病毒载体，如莫洛尼鼠白血病病毒（Moloney murine leukemia virus, MMLV）衍生的载体，来递送治疗性转基因。γ-逆转录病毒整合到宿主基因组是由细胞BET家族蛋白（BRD2、BRD3和BRD4）与病毒整合酶相互作用驱动的。然而，插入性淋巴瘤发生（insertional lymphomagenesis）可以独立于BET发生。早期某些逆转录病毒基因疗法导致白血病的主要原因是插入性诱变（insertional mutagenesis），特别是通过原癌基因激活。逆转录病毒的致癌潜力是众所周知的。致癌逆转录病毒可分为两类：急性转化逆转录病毒和非急性逆转录病毒。急性转化逆转录病毒因其病毒癌基因（viral oncogenes）的表达而诱导肿瘤；非急性逆转录病毒通过激活宿主细胞中的细胞原癌基因（cellular proto-oncogenes）诱导肿瘤，这是通过前病毒DNA插入到激活的原癌基因附近实现的。后一种机制为逆转录病毒基因治疗载体带来了致癌风险。虽然大多数整合是无害的，但如果病毒插入原癌基因区域内或附近，可能破坏正常的基因调控并潜在导致癌基因过度表达。载体插入可通过以下机制促进转化：（1）增强子激活原癌基因表达；（2）启动子插入导致邻近原癌基因表达刺激；（3）插入性失活肿瘤抑制基因；（4）破坏剪接或产生影响稳定性的3‘ mRNA截短，导致异常表达。早期成功疗法使用MMLV长末端重复序列（LTR）元件作为启动子表达转基因。病毒LTR是一个具有已知结构的强启动子，细分为U3、R和U5三个区域。U3区域包含转录起始所需的序列，包括基础启动子元件和上游增强子。前病毒由细胞RNA聚合酶II转录通常在上游LTR的U3-R边界启动，RNA切割/聚腺苷酸化在下游LTR的R-U5边界发生。当前病毒以相同转录方向整合在原癌基因上游时，一个LTR中的启动子和增强子元件可以通过病毒LTR的转录通读增加原癌基因的表达水平，覆盖原癌基因的正常转录控制，这一过程称为启动子插入。从文献中描述的案例可见，启动子插入是γ-逆转录病毒治疗中白血病发生的主要风险因素。最早且记录最充分的白血病案例发生在21世纪初的X连锁重症联合免疫缺陷（X-linked severe combined immunodeficiency, X-SCID）实验中。X-SCID疗法使用携带IL2RG转基因的有缺陷的MMLV产生载体，用于转导自体CD34+细胞。临床实验显示多例T细胞急性淋巴细胞白血病（T cell acute lymphoblastic leukemia）。整合位点分析发现白血病发生直接与LMO2癌基因位点及CCND2位点的插入相关。CCND2编码细胞周期蛋白D2，是淋巴细胞的已知癌基因。LMO2是γ-逆转录病毒整合的常见插入位点，因为CD34+细胞中该位点的染色质处于开放状态，其异常表达与T细胞白血病密切相关，其作为原癌基因通过异位表达转化正常胸腺细胞为白血病细胞的能力已被公认。病毒载体包含完整的LTR（作为IL2RG表达的启动子和增强子）这一事实对癌基因激活至关重要。类似地，LMO2致癌位点的插入也是ADA-SCID疗法（基于MMLV载体）中白血病发生的原因。在慢性肉芽肿病（chronic granulomatous disease）案例中，使用SF71gp91pho逆转录病毒载体转导CD34+细胞。在该载体中，gp91phox表达由Friend mink细胞脾病灶形成病毒LTR驱动，该LTR在干细胞和髓系祖细胞中具有高活性。多个临床实验报告了伴有单体7的骨髓增生异常综合征（myelodysplasia with monosomy 7），原因是MECOM、PRDM16和SETBP1位点的插入性诱变。MDS-EVI1复合体位点（MECOM）是众所周知的参与髓系白血病发生和染色体不稳定的原癌基因。研究表明，EVI1在人类细胞中强制过表达可导致正常中心体复制中断，这是基因组不稳定的风险因素，可能有助于7号染色体的丢失——治疗相关骨髓增生异常中的典型发现，驱动恶性进展。单体7与白血病发生相关，尤其是在髓系恶性肿瘤如骨髓增生异常综合征和急性髓系白血病中，是最明确的预后不良细胞遗传学异常之一。7号染色体的丢失导致该染色体上关键肿瘤抑制基因（如SAMD9、SAMD9L、EZH2和MLL3）的单倍剂量不足。EVI1过表达与基因组不稳定相关，7号染色体的丢失可能进一步去除肿瘤抑制基因，形成高度侵袭性的多打击白血病。在另一项研究中，一名慢性肉芽肿病患者接受MMLV衍生的MFGS-gp91phox载体治疗，32个月后因载体整合到MECOM位点出现骨髓增生异常。造血的最初异常伴有可能的继发性突变，导致克隆优势并随后发展为白血病。MFGS整合到MECOM位点产生克隆扩增，但未诱导染色体改变。原始细胞转化仅在获得额外遗传损伤（WT1肿瘤抑制基因双等位基因丢失）后发生，展示了经典的双打击白血病发生模型。这一结果证实肿瘤发生可能具有复杂起源，不应简化为单一风险因素。例如，同一2023年案例还揭示了一种新机制：骨髓增生异常原始细胞中的CYBB转基因包含超过100个由APOBEC3家族酶引起的G-to-A突变，这种超突变可能使治疗性转基因失活，让恶性前克隆逃避任何生长劣势并进一步增殖。这一重要发现阐明了预处理treatment中预先存在的遗传损伤在白血病发展中的作用。预处理（pre-treatment conditioning）可能具有诱变效应，放大恶性转化风险。威斯科特-奥尔德里奇综合征（Wiskott–Aldrich syndrome）的基因替代疗法基于长臂猿白血病病毒（gibbon ape leukemia virus, GALV）-γ-逆转录病毒载体，其中MMLV LTR被相应的骨髓增殖性肉瘤病毒LTR替换，且正常MMLV tRNA引物结合位点被谷氨酰胺tRNA引物结合位点取代。后续分析显示整合在LMO2、MECOM和MN1位点。MN1是一种转录因子，参与脑膜瘤。由于γ-逆转录病毒载体的白血病发生潜力和技术限制，更近期的基因治疗策略越来越多地使用慢病毒载体，后者能转导非分裂细胞，作为基因替代载体更为灵活。与γ-逆转录病毒不同，慢病毒的整合由LEDGF/p75蛋白驱动，该蛋白是慢病毒整合酶的直接结合伙伴。γ-逆转录病毒插入集中在转录起始位点附近及CpG岛和DNAseI超敏位点等特征区域，而慢病毒插入倾向于遍布整个基因，两者都倾向于在转导细胞中活跃的基因内或附近整合。这种不同的整合模式使慢病毒载体具有更有利的安全性特征。然而，这并不意味着慢病毒的整合谱完全安全；基因内整合可能导致肿瘤抑制基因的插入性失活或产生异常剪接。自失活（self-inactivating, SIN）慢病毒载体是为提高安全性而开发的，在3’ LTR U3区域进行关键删除，这种修饰在逆转录过程中转移到5‘ LTR，消除了整合后LTR的启动子/增强子活性，降低了产生复制能力逆转录病毒的风险，减轻了插入性诱变。转基因表达由此由内部启动子驱动，从而大大降低了启动子激活原癌基因的概率。SIN设计还防止了LTR与内部启动子之间潜在的转录干扰。尽管SIN慢病毒载体在设计上更为安全，但仍不能完全预防靶向CD34+细胞的基因治疗中的白血病发生。近期案例描述了接受基于慢病毒的脑肾上腺脑白质营养不良（cerebral adrenoleukodystrophy）（elivaldogene autotemcel）治疗的患者的血液系统恶性肿瘤。Lenti-D载体包含一个病毒衍生的合成调控元件，包括骨髓增殖性肉瘤病毒LTR的U3片段（缺失负调控区）并替换了DL587内源性逆转录病毒引物结合位点（修饰的MLV LTR启动子MNDU3）。MNDU3是源自骨髓增殖性肉瘤病毒U3区的强组成型内部启动子，其强度正是造成白血病发生风险的问题所在。该案例中的整合模式与γ-逆转录病毒整合引起的白血病相当，整合位点分析显示在多个位点包括MECOM-EVI1、PRDM16、SMG6、SLCA16、INO80等的插入。需要指出的是，该案例的设计特定性源于使用强病毒启动子MNDU3，而在其他慢病毒载体中，使用较弱的基因特异性启动子以达到生理表达水平，从而防止基因毒性和癌基因激活。有趣的是，一名接受HPSC慢病毒基因治疗的镰状细胞病患者，其急性髓系白血病细胞在VMA4附近含有一个克隆插入位点，但该基因从未与癌症相关，且未检测到该基因或插入位点附近任何其他基因的表达变化，预先存在的单体7是该案例中白血病发生的原因。该案例被认为与BB305慢病毒插入无关。使用低病毒载体拷贝数（vector copy number, VCN）可降低插入性诱变风险，一般将VCN限制在2以下以减少风险，但这可能对某些疾病不足。一些现有治疗载体包含复杂的转基因表达盒，除启动子外还有增强子和/或控制位点；例如，治疗血红蛋白病的载体包含具有长程增强子活性的位点控制区（locus control regions），这些增强子可能潜在导致前病毒附近基因的异常表达，但迄今为止未观察到相关白血病案例。这些证据表明，病毒基因替代疗法后肿瘤发生的主要风险因素是强病毒启动子对原癌基因的激活。对于γ-逆转录病毒载体，病毒LTR充当启动子，因此致癌潜力是其固有特性。SIN慢病毒载体设计去除了LTR的启动子活性，转基因表达由内部转基因启动子驱动，因此该启动子的选择决定了转基因表达水平和载体的致癌潜力。在与脑肾上腺脑白质营养不良治疗（Skysona）相关的白血病案例中，使用了强逆转录病毒启动子，结果在激活原癌基因方面与γ-逆转录病毒载体相似。因此，较弱和/或细胞谱系特异性启动子更可取，以预防病毒载体引起的肿瘤发生。
3. Conditioning in Autologous HPSC Therapy
临床案例的分析表明，预先存在的基因组损伤（特别是肿瘤抑制基因的丢失）为启动子插入下的白血病发生创造了条件。因此，有必要讨论靶细胞的分离及相关程序。离体HPSC修饰的必要步骤是分离富含HPSCs的细胞群体。基因修饰的靶细胞通常基于表面糖蛋白进行分类，CD34+细胞是HPSC基因修饰的常见靶点。它们是从骨髓、脐带血和外周血中发现的细胞群体，特征为表达CD34表面糖蛋白，是含干细胞和祖细胞的富集群体，尽管单独CD34表达并不能定义真正的长期造血干细胞。它们在白血病和淋巴瘤等疾病的清髓治疗（myeloablative therapies）后重建血液和免疫系统中必不可少。离体基因替代疗法包括几个关键步骤：从外周血或骨髓收集CD34+细胞、使用病毒载体进行基因修饰、移植前预处理（pre-transplantation conditioning）以及移植修饰后的细胞。并非所有基因替代疗法中的白血病案例都由插入性诱变引起；其他风险因素包括基因毒性预处理。预处理的目标是清除宿主细胞以创造空间供基因修饰细胞植入，同时提供支持植入的细胞因子释放，并防止对转基因的免疫反应。因此，预处理方案需在实现这些目标与避免过度毒性之间取得平衡。预处理方案通常包含化疗药物，如白消安（busulfan）、环磷酰胺（cyclophosphamide）和氟达拉滨（fludarabine），这些药物通过DNA损伤产生细胞毒性，其DNA损伤缺乏选择性，会创造诱变环境，促进致病突变出现。HPSCs的来源影响预处理选择，内源性骨髓消融、干细胞支持和血细胞减少程度是选择预处理方案的考虑因素。方案按强度分为清髓性（myeloablative）、减低强度预处理（reduced intensity conditioning）和非清髓性（non-myeloablative）。不同疾病需要不同的预处理方案，包括所需基因表达比例、器官特异性表达要求以及基因校正群体的存活或植入优势。例如，血红蛋白病需要30-50%的正常血红蛋白产量，但在基因修饰造血干细胞疗法中实现足够植入需要完全清髓。由于使用自体细胞理论上消除了移植物排斥和移植物抗宿主并发症的风险，对于某些疾病可以容忍基因修饰和未修饰细胞的稳定嵌合状态，这可通过减低强度方案实现。对于影响神经系统的代谢疾病，需要清髓性治疗以清除中枢神经系统中的驻留免疫细胞，以便从基因修饰造血干细胞衍生的新小胶质细胞植入。较温和的方法通常不足以达到血红蛋白病或溶酶体贮积症表型矫正所需的高植入水平。由于需要高酶表达水平以及针对所产生酶的免疫反应风险，代谢疾病通常采用完全清髓和免疫消融方案以优化结果。清髓过程创造了巨大的选择压力，当血液系统从有限数量的植入的基因校正干细胞再生时，任何具有载体插入所赋予生长优势的恶性前克隆都可能优先扩增。插入性诱变不受预处理直接影响，但未修饰的宿主细胞受到诱变效应、增加的选择压力（可能导致克隆优势）和免疫力降低的影响，所有这些都是致癌的。例如，在Kanter等人2023年的研究中，一例白血病并非由插入性诱变引起，而是由单体7引起，作者将其归因于白消安的使用。单体本身可能直接与白消安预处理相关，也可能不相关，如先前所述，白血病发生是多因素过程。从表1可见，针对血红蛋白病（β-地中海贫血和镰状细胞病）的疗法，尽管使用了SIN慢病毒载体和谱系特异性启动子，仍存在白血病发生风险，这可能与疾病特定条件有关。与血红蛋白病相关的慢性炎症、应激性红细胞生成和骨髓缺氧可能使骨髓易产生基因组不稳定性，导致该人群中克隆性造血几率增加和体细胞突变积累。在基因毒性预处理方案（如高剂量白消安）的胁迫下，预先存在的突变可扩增。预处理在白血病发生中的作用是多方面的，通过直接诱变（DNA损伤剂）、有利于预先存在克隆的选择压力、免疫抑制和骨髓微环境重塑等因素的组合发挥作用。即使预处理不直接导致白血病发生，它也可能为病毒插入产生的白血病克隆创造有利环境。
4. Conclusions
总之，早期HPSC实验中白血病的高发生率是一次悲剧但关键的生物学教训，突显了使用设计不当的载体永久性修饰干细胞的巨大力量和风险。逆转录病毒基因替代疗法主要通过强大的病毒增强子对原癌基因（如LMO2或MECOM）的插入性激活导致白血病。基于这些见解，现代自失活慢病毒载体显著提高了安全性，使基因疗法成为许多疾病可行的救命治疗。根据现有数据，慢病毒载体因其自失活设计，白血病发生风险大大降低。自失活载体在病毒载体的U3长末端重复区域缺失，阻止了载体骨架的启动子活性。慢病毒基因修饰后观察到的白血病案例是由转基因表达盒中使用强病毒启动子引起的，与慢病毒载体元件无直接关联。代谢疾病存在特殊风险，其中升高的转基因表达需求与必要的清髓预处理相结合，高表达需要较强启动子（有启动子插入风险），而清髓预处理造成诱变环境并伴有免疫力降低，这一组合因素使白血病发生风险增高。解决基因替代疗法中肿瘤发生问题的几种可能方法应联合使用：使用慢病毒载体、使用自失活载体、较弱的内部启动子、最小化载体拷贝数、在适当时筛查克隆性造血或细胞遗传学异常、优化预处理强度以及进行长期整合位点监测。尽管如此，病毒整合入宿主基因组及随后的插入性诱变仍然是统计学过程，不能解释每个特定的肿瘤发生或未发生案例而不考虑纯随机因素。但所有这些为风险缓解而开发的方法都是在安全与效率之间寻找平衡的产物，它们能在相当程度上降低致癌风险，但治疗后监测仍然是必要的，并将始终是必要的。
