显著的抗原差异与2013–2022年中国东部野生鸟类H5禽流感病毒的进化分析

《Animals》：Marked Antigenic Divergence and Evolutionary Analysis of H5 AIVs from Wild Birds in East China, 2013–2022

　　

高致病性H5亚型禽流感病毒（AIVs）因其高致死率和大流行潜力，持续对家禽业和公共卫生构成威胁。迁徙野生鸟类作为天然储库和远距离传播载体，在病毒的全球传播和基因重配中发挥关键作用，驱动其时空扩散。然而，中国东部野生鸟类中流行的H5 AIVs的抗原差异程度及进化驱动因素仍不明确。本研究旨在揭示2013至2022年间中国东部野生鸟类中分离的H5 AIVs的进化动态和抗原差异。通过全基因组测序和系统发育分析，研究人员发现这些分离株属于多个分支，包括2.3.2.1和2.3.4.4，并涵盖H5N1、H5N6和H5N8亚型。关键氨基酸位点分析显示，HA和NA蛋白的糖基化位点模式在不同分支间存在差异，部分毒株出现糖基化位点的获得或缺失，而某些毒株已获得与哺乳动物适应相关的突变。交叉血凝抑制（HI）试验结合抗原图谱分析表明，大多数分离株与当时中国使用的疫苗株在抗原上匹配良好，提示这些疫苗有效覆盖了当时流行的主要抗原变异株。尽管如此，部分流行株与疫苗株之间仍观察到潜在的抗原错配。这些发现提示，中国东部的野生鸟类可能促进了H5 AIVs的区域传播和多样化，强调了持续监测对早期预警和疫苗株评估的价值。

**论文解读：2013–2022年中国东部野生鸟类H5禽流感病毒的抗原差异与进化分析**

**研究背景与问题**

高致病性H5亚型禽流感病毒（Avian Influenza Viruses，AIVs）对全球家禽业和公共卫生构成严重威胁，因其高致死率和跨物种传播潜力。野生鸟类（尤其是雁形目和鸻形目）是AIVs的自然储库和远距离传播载体，在病毒的长期维持、传播和进化中起关键作用。中国东部位于东亚–澳大利西亚候鸟迁徙路线（East Asian–Australasian Flyway）的关键节点，拥有丰富的湿地资源和多样的野生鸟类栖息地，同时集约化家禽养殖和活禽市场增加了野生与家养禽类的接触机会。然而，关于中国东部野生鸟类中H5 AIVs的遗传进化和抗原变异的长期系统监测数据仍十分有限。因此，研究人员开展了本研究，旨在阐明2013–2022年间该地区野生鸟类中H5 AIVs的传播动态和分子进化趋势，为禽流感暴发早期预警、疫苗株选择和区域特异性防控策略提供科学依据。

**主要技术方法**

研究人员于2013–2022年间在中国东部主要淡水湖和自然湿地（包括江苏太湖、高邮湖、洪泽湖，浙江杭州湾，上海崇明岛）采集了共27,000份野生鸟类粪便和环境样本，样本来源以雁形目、鸻形目及其他水鸟为主。通过SPF鸡胚进行病毒分离，经三次空斑纯化确保遗传均一性。采用全基因组测序获得16株H5 AIVs的完整基因组序列。系统发育分析基于最大似然法（Maximum Likelihood，ML）并利用PhyloSuite和IQ-TREE构建。分子特征分析包括HA和NA蛋白的潜在糖基化位点预测（NetNGlyc 1.0）及关键氨基酸突变位点分析。选择压力分析采用Datamonkey服务器上的FEL、MEME、FUBAR和SLAC四种算法。抗原分析通过交叉血凝抑制（Hemagglutination Inhibition，HI）试验和抗原图谱（Antigenic Cartography）评估分离株与疫苗株的抗原关系。

**研究结果**

**3.1 流行率与测序**：通过病毒分离和鉴定，从27,000份样本中获得16株H5亚型AIVs，总体分离率为0.6‰。其中12株来自江苏省（75.0%），3株来自上海（18.8%），1株来自浙江省（6.2%）。经三次空斑纯化后获得所有毒株的完整基因组序列。

**3.2 系统发育关系**：HA基因系统发育分析表明，H5N1亚型中CM120属分支2.3.2.1e，JYWB4和DT10属分支2.3.2.1d，YX01属分支2.3.4.4b；H5N6亚型中GY183属分支2.3.4.4e，GY999等属分支2.3.4.4d，DF10等属分支2.3.4.4h；H5N8分离株CIXI20属分支2.3.4.4b。NA基因分析显示四个H5N1病毒分布在三个组，十一个H5N6病毒均属欧亚谱系，CIXI20的N8基因与Re-14疫苗株密切相关。内部基因（PB2、PB1、PA、NP、M、NS）的系统发育树显示病毒具有多源重配特征，不同基因节段来源多样，部分源自H9N2亚型或早期Gs/GD/96谱系。

**3.3 分子特征**：所有16株H5亚型AIVs的HA裂解位点均含有多碱性氨基酸基序（PQRERRRKR↓GLF或PLRERRRKR↓GLF），符合高致病性禽流感分子特征。糖基化位点分析显示HA蛋白有六个保守位点，但在不同分支中存在变异，如分支2.3.4.4h毒株在70位出现新位点NCSV。NA蛋白中，H5N1、H5N6、H5N8亚型各有其特异性糖基化模式，如H5N6毒株在51、59、134、190、391位存在位点，部分毒株在54位获得NPTT位点。此外，在NA、PB2、PA、NP、M1、NS1蛋白中鉴定出多个与致病性、宿主适应及抗病毒耐药性相关的氨基酸标记，如PB2 K389R、NP Y52H、M1 N30D/T215A等，提示这些野生鸟类来源的H5 AIVs已具备一定的哺乳动物适应潜力。

**3.4 基因选择压力分析**：对HA基因进行选择压力分析，发现多个位点（如131、136、156、239）具有较高的dN/dS值，其中131和156位点在MEME、FEL和FUBAR三种方法中均显示较强的正选择信号。疫苗株中检测到的正选择位点相对有限，主要为131、136和205位。

**3.5 抗原差异分析**：交叉HI试验和抗原图谱分析显示，分离株与疫苗株可分为多个抗原群。抗原距离计算表明，GY183与JYWB4之间距离最大（8.94抗原单位），其次为CIXI20与Re-13（8.65单位）、GY183与Re-13（8.63单位）、GY183与Re-12（8.32单位）。GY183和CIXI20表现出最显著的抗原差异，尤其是GY183与近期疫苗株Re-12、Re-13、Re-15距离较大（8.04–8.63单位），表明早期流行株与当前疫苗株之间存在明显抗原间隙。相反，DT10和SH17与同期疫苗株Re-11的抗原距离较小，提示这些毒株与当时中国疫苗株抗原匹配良好。但CIXI20与其同期疫苗株Re-12、Re-13存在较大距离（6.87和8.65单位），表明部分流行株与现行疫苗之间仍存在潜在抗原错配。

**讨论与结论**

讨论指出，本研究中发现的H5病毒遗传多样性（涵盖2.3.2.1和2.3.4.4等多个分支及H5N1、H5N6、H5N8亚型）与全球H5Nx谱系向分支2.3.4.4b优势转换的趋势一致。2020年和2022年检测到分支2.3.4.4b病毒（CIXI20/2020和YX01/2022），而2016–2019年的H5N6病毒主要属分支2.3.4.4d、2.3.4.4e和2.3.4.4h。所有毒株HA裂解位点含多碱性氨基酸，证实高致病性病毒存在。HA和NA糖基化模式变化及正选择位点（如131和156位）提示免疫选择和宿主适应促使抗原多样化。检测到的哺乳动物适应标记（如PB2、NP等）值得关注，尤其是在全球分支2.3.4.4b病毒在哺乳动物中频繁检出的背景下。抗原分析显示多数野生鸟类分离株与同期中国疫苗株匹配良好，但GY183和CIXI20等毒株存在明显抗原差异，强调持续监测野生鸟类对早期预警和疫苗更新的价值。研究局限性包括：10年间仅分离16株病毒，年份分布不均，无法评估真实流行率和进化连续性；抗原分析仅基于体外HI试验，未通过体内攻毒实验验证保护效果。未来需结合纵向采样、环境与宿主数据、家禽暴发数据和体内实验以阐明传播途径和疫苗相关性。

结论：对中国东部野生鸟类的监测发现了具有遗传多样性、抗原异质性及携带多种哺乳动物适应分子标记的H5亚型AIVs。尽管分离株数量有限，但多个亚型和分支的检出表明该地区野生鸟类可能参与了H5 AIVs的区域传播和遗传多样化。这些结果支持将野生鸟类监测作为禽流感早期预警和疫苗株评估的补充手段。