《Biomaterials》：Lipo-protein Deposition Strategy Towards Smart Microspheres with Bacterial Toxin Triggered “Adsorption-Pore Formation-Immune Regulation” Cascade Reaction for Sepsis Treatment
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Ziyue Ling|Xijing Yang|Xianda Liu|Shifan Chen|Ningyue Deng|Yujie Xiao|Wenjie Wang|Jianxu Bao|Yuhui Feng|Hongyu Xiang|Yilin Wang|Xin Song|Cha
Ziyue Ling|Xijing Yang|Xianda Liu|Shifan Chen|Ningyue Deng|Yujie Xiao|Wenjie Wang|Jianxu Bao|Yuhui Feng|Hongyu Xiang|Yilin Wang|Xin Song|Changsheng Zhao|Weifeng Zhao
四川大学高分子科学工程学院，先进聚合物材料国家重点实验室，中国成都，610065
摘要
革兰氏阳性菌引发的脓毒症会导致免疫紊乱以及多器官损伤，这类损伤是由孔形成毒素引起的，这类毒素会在宿主细胞膜上直接形成孔洞，进而加剧细胞损伤。传统药物治疗无法清除已存在的细菌毒素，反而会在细菌裂解时增加毒素释放，从而加重炎症反应。目前用于清除毒素的材料缺乏调节微环境的能力，还存在在体内滞留的风险。本研究提出了一种智能微球，可通过细菌毒素触发“吸附-孔形成-免疫调节”级联反应。通过“脂质-蛋白质沉积”策略，将对α毒素具有高亲和力的脂质体（KD=5.355×10-8 M）固定在聚醚砜微球上，制备出用于体外血液净化的PES-L-Lipo-RL微球。毒素的吸附会促使脂质体上的孔洞形成，进而释放药物，抑制细菌增殖并调节免疫微环境（CD86阳性巨噬细胞的比例从23.9%降至7.6%）。此外，细菌的毒力基因（hla、agrA）表达也会降低，从源头减少毒素的产生。在兔脓毒症模型中，PES-L-Lipo-RL微球能显著降低细菌负荷（1小时内抗菌率超过99%），减轻细胞因子的释放，避免多器官损伤，还将28天存活率提升至100%。这种整合了毒素吸附与免疫调节的智能级联反应，为脓毒症治疗提供了一种高效且安全的方法。
引言
脓毒症是一种由宿主对感染的反应失调所引发的系统性炎症反应综合征，会导致多器官功能障碍甚至死亡[1]。它已成为全球范围内严重的公共卫生问题，发病率和死亡率都很高[2]。细菌感染是脓毒症的主要病因[3]、[4]，而细菌释放的毒素在脓毒症的病理过程中起着关键作用[5]、[6]。尤其是革兰氏阳性菌分泌的孔形成毒素，作为细菌的毒力因子，不仅能帮助细菌定植和扩散，还会在宿主细胞膜上直接形成孔洞，进一步加剧细胞损伤和炎症反应[7]、[8]、[9]、[10]。目前的临床治疗手段主要以抗生素和免疫调节剂等药物为主。虽然这些药物可以杀死细菌或调节免疫反应，但无法清除细菌已释放的毒素。更严重的是，抗生素治疗还可能因细菌裂解而增加毒素释放，从而恶化微环境[11]、[12]。为了解决毒素负荷过重的问题，人们研发出了多种纳米材料作为诱饵来中和毒素，这些材料虽能快速降低毒素浓度，却无法改善受损的微环境，且留在血液中的毒素结合复合物仍存在风险[13]、[14]。因此，亟需开发一种既能吸附毒素又能调节免疫微环境的安全有效方法来治疗脓毒症。
脂质体不仅是出色的药物载体，由于其结构与细胞膜高度相似，也是孔形成毒素的天然靶标[15]、[16]、[17]、[18]、[19]。具体而言，脂质体上的磷胆碱基团对毒素具有很高的亲和力，同时其稳定有序的脂质微区域有助于毒素在脂质体表面聚集和聚合成寡聚体[18]、[20]、[21]。模仿孔形成毒素在宿主细胞膜上形成孔洞导致细胞渗漏的病理过程，被脂质体吸附的毒素也可在脂质体表面形成孔洞，从而促使内部药物释放[22]、[23]、[24]、[25]、[26]。利用这一特性，脂质体可以被设计成智能级联反应器[27]。具体来说，孔形成毒素的吸附会直接促使封装在脂质体中的药物释放，进而发挥治疗和调节作用，减轻毒素引发的炎症级联反应。尽管脂质体具有这样的应用潜力，但由于其在血液中可能存在残留的毒素结合脂质体，其可回收性较差，限制了其在脓毒症治疗中的应用[28]。
近年来，基于类淀粉蛋白聚集的表面修饰技术受到了广泛关注[28]、[29]、[30]、[31]。在特定的二硫键还原剂存在下，具有分子内二硫键且易形成纤维结构的蛋白质（如溶菌酶、血清白蛋白和乳铁蛋白）会发生构象变化，展开并重新组装成富含β折叠片的类淀粉结构。这样一来，这些蛋白质会暴露出大量的活性功能基团和疏水位点，使其能够通过疏水相互作用、氢键和π-π堆叠等强非共价作用，与各种表面实现牢固结合[32]、[33]、[34]。因此，我们推测，利用溶菌酶的相变蛋白作为分子黏合剂，有望实现将脂质体稳定固定在聚合物基底上，从而通过体外循环有效治疗脓毒症，避免体内残留毒素结合脂质体的风险[35]、[36]、[37]、[38]、[39]、[40]。
本研究设计了具有细菌毒素触发“吸附-孔形成-免疫调节”级联反应的智能微球，用于脓毒症治疗。具体而言，采用“脂质-蛋白质沉积”策略来制备这些微球。首先将利福平和木犀草素装载到脂质体中，再通过溶菌酶对其进行处理，得到脂质-蛋白质复合物L-Lipo-RL。在三(2-羧乙基)膦的作用下，溶菌酶会发生相变，充当分子黏合剂，将功能脂质体高效且稳定地固定在聚醚砜微球上，最终得到PES-L-Lipo-RL微球。在血液净化过程中，固定在微球表面的脂质体可以吸附细菌分泌的孔形成毒素，而被捕获的毒素形成的孔洞又会触发封装药物的释放。释放出的利福平可以抑制细菌生长，而木犀草素则可以调节免疫微环境，降低细菌毒力基因的表达，从源头减少细菌毒素的产生（见图1）。这种智能级联反应实现了毒素吸附与免疫调节的协同作用，为多维度治疗脓毒症提供了一种高效且安全的方法。
章节节选
脂质-蛋白质沉积的制备与表征
受类淀粉蛋白沉积策略的启发，我们将溶菌酶接枝到脂质体上，旨在通过“脂质-蛋白质沉积”策略将脂质体固定在聚醚砜微球上（见图1A）。首先，我们制备了未加载药物的溶菌酶修饰脂质体L-Lipo，以验证该策略的可行性。通过脂质体上的活性酯基团(-NHS)与溶菌酶的氨基发生反应，成功制备出了溶菌酶修饰脂质体L-Lipo。
结论
在本研究中，我们通过“脂质-蛋白质沉积”策略成功制备出了具有细菌毒素触发“吸附-孔形成-免疫调节”级联反应的智能微球PES-L-Lipo-RL，该微球兼具毒素吸附与免疫微环境调节功能。实验结果表明，“脂质-蛋白质沉积”策略能够高效且稳定地将脂质体固定在微球表面，从而实现安全高效的体外
伦理声明
所有生物实验均得到了四川大学华西医院的批准，并严格按照相关法律法规（GB/T 16886.4-2003/ISO 10993-4:2002）开展。涉及人类血液的实验也获得了四川大学华西医院的批准（伦理审批编号：2024553，ChiCTR.org.cn注册编号：ChiCTR2400083626）。本研究中的动物实验也遵循了相关的伦理指导原则
CRediT作者贡献说明
Ziyue Ling：撰写——初稿撰写、可视化分析、验证、方法设计、实验研究、正式分析、数据整理、概念构思。Yilin Wang：撰写——审阅与编辑。Hongyu Xiang：实验研究。Yuhui Feng：实验研究。Jianxu Bao：实验研究。Wenjie Wang：实验研究。Yujie Xiao：验证、实验研究。Ningyue Deng：方法设计、实验研究。Shifan Chen：方法设计、实验研究。Xianda Liu：方法设计、实验研究。Weifeng Zhao：撰写——审阅与编辑。
数据可用性声明
本研究的相关数据可在合理请求下向通讯作者获取。
利益冲突声明
? 作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：52473139、52373149）以及四川省基础研究领军人才计划（2025JDKXJ0004）的资助。我们感谢团队所有成员的鼎力支持，同时也感谢四川大学华西医院实验动物中心的Xijing Yang，在动物实验过程中给予了我们极大的帮助。此外，病理技术方面的支持也
