IP3R1介导的钙离子超载通过膜锚定金属蛋白酶促进SAH诱导的神经元凋亡

《Cellular Signalling》：IP3R1-mediated Ca2+ overload promotes SAH-induced neuron apoptosis through MAMs

　　

Zhonghua Zhang|Peipei Shen|Lin Zong|Lidong Zhang

中国江苏省南京市210000，南京医科大学金陵学院临床医学系，金陵医院麻醉科

摘要

背景

动脉瘤性蛛网膜下腔出血是一种严重的急性出血性脑卒中。内质网与线粒体之间通过线粒体相关膜进行沟通，这对维持神经元稳态至关重要。本研究旨在探讨线粒体相关膜上内质网与线粒体耦合的破坏——表现为接触距离和面积的改变——是否通过IP3R1/GRP75/VDAC1复合物促进病理性钙离子转移，从而加剧蛛网膜下腔出血后的早期脑损伤。同时，我们还会研究针对这一复合物的治疗潜力。

方法

研究使用了暴露于氧合血红蛋白的初级皮层神经元以及蛛网膜下腔出血的小鼠模型。我们检测了线粒体相关膜结构的动态变化（内质网与线粒体的距离、接触长度）、内质网应激状况以及钙离子处理情况。通过shRNA介导的IP3R1敲低和慢病毒介导的过表达实验，研究了IP3R1在维持线粒体相关膜完整性、调节内质网应激标志物（p-eIF2α、ATF4、CHOP）、控制钙离子动态以及抑制神经元凋亡中的作用。

结果

蛛网膜下腔出血发生后，内质网与线粒体的距离显著减小，而线粒体相关膜的接触面积则增大，与此同时IP3R1/GRP75/VDAC1复合物的表达也上升。这些变化伴随着内质网应激加剧以及细胞质和线粒体中钙离子水平的升高。敲低IP3R1能够逆转蛛网膜下腔出血导致的线粒体相关膜结构异常，减轻内质网应激，降低钙离子超载，进而减少神经元凋亡并改善神经功能缺陷。相反，过表达IP3R1则会进一步加重这些病理表现。

结论

通过IP3R1/GRP75/VDAC1复合物导致的病理性内质网与线粒体耦合增强，是蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中钙离子介导的神经元凋亡的重要诱因。有针对性地降低IP3R1的表达有望恢复线粒体相关膜的稳态，进而减轻脑损伤，是一种具有前景的治疗策略。

引言

动脉瘤性蛛网膜下腔出血是一种致残率和死亡率都很高的急性出血性脑卒中[1]。早期脑损伤指的是蛛网膜下腔出血后3天内全脑出现的急性损伤，它是导致高死亡率和不良预后的主要因素[2]。越来越多的证据表明，蛛网膜下腔出血后的早期脑损伤涉及多种病理过程，包括内质网应激、神经炎症、微循环障碍、线粒体功能障碍、自噬失调以及神经元死亡[3]、[4]、[5]。尽管由于先进的治疗手段，患者的生存率有所提高，但仍有许多患者存在长期的神经功能缺陷，这凸显出需要新的治疗策略来应对早期脑损伤[6]。

内质网是细胞内的主要钙离子储存库，对蛋白质折叠和细胞信号传导起着关键作用[7]、[8]、[9]。线粒体则是能够产生ATP并调控细胞死亡的动态细胞器，它们之间的功能互动是通过线粒体相关内质网膜来实现的，这类特殊的结构和功能平台能够促进钙离子、脂质以及代谢信号的传递[10]。线粒体相关膜上的IP3R1/GRP75/VDAC1复合物是内质网向线粒体输送钙离子的主要通道，能够调控ATP的产生以及细胞的命运。线粒体相关膜的结构破坏与多种神经退行性疾病有关。

IP3R1是一种定位于内质网的钙离子释放通道，GRP75是一种分子伴侣，VDAC1则是线粒体外膜上的通道。三者共同在线粒体相关膜上形成一种物理复合物，作为内质网向线粒体输送钙离子的主要途径。在正常生理状态下，该复合物有助于维持线粒体的能量代谢和细胞存活，但在病理应激条件下，其过度激活会导致线粒体钙离子超载、内质网应激以及神经元凋亡。已有研究指出，该复合物的功能失调与脑卒中[11]、创伤性脑损伤[12]以及多种神经退行性疾病[13]之间存在关联。我们根据初步的组学数据（图S1A、B），发现蛛网膜下腔出血后IP3R1的表达上升，钙离子信号通路也出现活跃，由此推测IP3R1/GRP75/VDAC1复合物可能通过异常的线粒体相关膜钙离子信号传导机制引发早期脑损伤。

我们之前的研究[14]已经发现胰岛素抵抗和内质网应激与蛛网膜下腔出血后的早期脑损伤有关。通过对蛛网膜下腔出血后小鼠颞叶皮层的无目标组学分析，我们发现定位于内质网的IP3R1表达出现差异（图S1A），同时钙离子信号通路也更为活跃（图S1B）。因此我们推测，IP3R1的功能失调会改变线粒体相关膜的结构和功能——具体来说就是影响内质网与线粒体之间的距离和接触面积——进而导致病理性的钙离子转移和内质网应激，最终造成蛛网膜下腔出血后的早期脑损伤。本研究旨在阐明这一机制，并评估调节IP3R1的治疗潜力。

章节节选

初级神经元培养

初级皮层神经元的获取方法如前文所述[14]、[15]，即从C57/BL6胎鼠（E16–18阶段）中分离获得。具体操作为：首先对胎鼠进行颈部断离处理并进行消毒，然后取出胎鼠大脑，解剖出大脑皮层，去除脑膜和血管，最后在37℃下用0.125%的胰蛋白酶处理15分钟。将处理后的细胞悬浮液通过40μm的滤器过滤，再以1000rpm的速度离心5分钟。随后将这些细胞接种在含有5%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中

蛛网膜下腔出血会导致线粒体相关膜出现动态的超微结构和分子层面的变化，同时伴随内质网应激和钙离子平衡紊乱

蛛网膜下腔出血小鼠的总体死亡率为24.1%，各实验组之间没有显著差异（图S1C）。其中5只蛛网膜下腔出血程度较轻的小鼠被排除在外。

对颞叶皮层进行的透射电镜分析（图1A）显示，蛛网膜下腔出血后会出现病理性的超微结构变化，包括细胞质空泡化、内质网扩张以及线粒体肿胀且嵴结构受损。定量分析（图1B-D）则表明，内质网与线粒体之间的距离显著减小，同时

讨论

动脉瘤性蛛网膜下腔出血后的早期脑损伤是一个复杂的病理过程，涉及神经炎症、内质网应激、线粒体功能障碍以及神经元死亡[3]、[4]、[5]。虽然血管痉挛一直是研究的重点，但越来越多的证据表明，除了血管痉挛之外，内质网应激、线粒体功能障碍以及血脑屏障破坏等因素也是导致临床预后不良的重要原因[18]。在本研究中，我们探讨了IP3R1在其中的作用

结论

综上所述，蛛网膜下腔出血会引发线粒体相关膜的结构重构，其表现为内质网与线粒体之间的距离减小，而接触面积则增大，这一变化是由IP3R1/GRP75/VDAC1复合物的表达上升所驱动的。这种结构重构会促使过多的钙离子从内质网转移到线粒体中，进而激活PERK-eIF2α-ATF4-CHOP内质网应激通路，最终导致神经元凋亡和神经功能缺陷。有针对性地降低IP3R1的表达可以恢复线粒体相关膜的正常结构，使钙离子动态恢复正常，

作者贡献声明

Zhonghua Zhang：负责论文的初稿撰写、软件应用、数据整理以及概念设计工作。Peipei Shen：负责论文的审阅与编辑工作。Lin Zong：负责研究资源的筹备以及资金申请工作。Lidong Zhang：负责数据的可视化处理以及资金申请相关工作。

伦理标准遵守情况

所有的实验操作以及动物饲养相关事宜（编号：DZGZRDW2400219）均已获得南京医科大学金陵学院临床医学系金陵医院伦理委员会的批准，所有实验均按照《赫尔辛基宣言》和《良好临床实践指南》的要求开展。

资金支持声明

本研究得到了中国博士后科学基金会的资助（编号：2024M754280）。

利益冲突声明

作者声明自己不存在任何可能影响本研究结果的已知财务利益或非财务利益。